Alzheimerin taudista (AD) puuttuu proteiinibiomarkkereita, jotka heijastavat sen monia taustalla olevia patofysiologioita, mikä estää diagnoosin ja hoidon etenemisen. Tässä käytämme kattavaa proteomiikkaa tunnistamaan aivo-selkäydinnesteen (CSF) biomarkkereita, jotka edustavat laajaa AD-patofysiologiaa. Multipleksimassaspektrometrialla tunnistettiin noin 3 500 ja noin 12 000 proteiinia AD-CSF:ssä ja aivoissa, vastaavasti. Aivojen proteomin verkkoanalyysi ratkaisi 44 biologisen monimuotoisuuden moduulia, joista 15 oli päällekkäin aivo-selkäydinnesteen proteomin kanssa. CSF AD-markkerit näissä päällekkäisissä moduuleissa on laskostettu viiteen proteiiniryhmään, jotka edustavat erilaisia patofysiologisia prosesseja. Synapsit ja metaboliitit AD-aivoissa vähenevät, mutta CSF kasvaa, kun taas glia-rikas myelinaatio ja immuuniryhmät aivoissa ja CSF:ssä lisääntyvät. Paneelin muutosten johdonmukaisuus ja sairausspesifisyys vahvistettiin yli 500 muussa CSF-näytteessä. Nämä ryhmät tunnistivat myös biologiset alaryhmät oireettomassa AD:ssa. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset ovat lupaava askel kohti verkkopohjaisia biomarkkerityökaluja AD:n kliinisiin sovelluksiin.
Alzheimerin tauti (AD) on yleisin neurodegeneratiivisen dementian syy maailmanlaajuisesti, ja sille on ominaista laaja valikoima biologisten järjestelmien toimintahäiriöitä, mukaan lukien synaptinen siirto, gliavälitteinen immuniteetti ja mitokondrioiden aineenvaihdunta (1-3). Sen vakiintuneet proteiinien biomarkkerit keskittyvät kuitenkin edelleen amyloidi- ja tau-proteiinin havaitsemiseen, eivätkä siksi voi kuvastaa tätä monimuotoista patofysiologiaa. Näitä "ydin" proteiinibiomarkkereita, jotka mitataan luotettavimmin aivo-selkäydinnesteestä (CSF), ovat (i) amyloidi-beetapeptidi 1-42 (Aβ1-42), joka heijastaa aivokuoren amyloidiplakkien muodostumista; (ii) kokonais-tau, merkki aksonin rappeutumisesta; (iii) fosfo-tau (p-tau), patologisen tau-hyperfosforylaation edustaja (4-7). Vaikka nämä aivo-selkäydinnesteen biomarkkerit ovat suuresti helpottaneet "merkittyjen" AD-proteiinisairauksien havaitsemista (4-7), ne edustavat vain pientä osaa taudin taustalla olevasta monimutkaisesta biologiasta.
AD-biomarkkerien patofysiologisen monimuotoisuuden puute on johtanut moniin haasteisiin, mukaan lukien (i) kyvyttömyys tunnistaa ja kvantifioida AD-potilaiden biologista heterogeenisuutta, (ii) taudin vakavuuden ja etenemisen riittämätön mittaaminen, erityisesti prekliinisessä vaiheessa, ja ( iii) sellaisten terapeuttisten lääkkeiden kehittäminen, jotka eivät täysin ratkaisseet kaikkia neurologisen heikkenemisen näkökohtia. Luottamuksemme maamerkkipatologiaan liittyvien sairauksien AD:n kuvaamisessa vain pahentaa näitä ongelmia. Yhä useammat todisteet osoittavat, että useimmilla vanhuksilla, joilla on dementia, on enemmän kuin yksi patologinen kognitiivisen heikkenemisen ominaisuus (8). Jopa 90 %:lla tai useammalla AD-patologiaa sairastavista yksilöistä on myös verisuonisairauksia, TDP-43-sulkeumia tai muita rappeuttavia sairauksia (9). Nämä suuret patologisten päällekkäisyyksien osuudet ovat häirinneet nykyistä dementian diagnostista kehystä, ja taudin kattavampi patofysiologinen määritelmä tarvitaan.
Koska tarvitaan kiireellisesti erilaisia AD-biomarkkereita, ala ottaa yhä enemmän käyttöön "omics"-menetelmää, joka perustuu kokonaisjärjestelmään biomarkkerien löytämiseksi. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance käynnistettiin vuonna 2014, ja se on ohjelman kärjessä. Tämä kansallisten terveysinstituuttien, tiedemaailman ja teollisuuden monitieteinen ponnistelu tähtää järjestelmäpohjaisten strategioiden avulla määrittämään paremmin AD:n patofysiologia ja kehittämään biologisen monimuotoisuuden diagnostisia analyysi- ja hoitostrategioita (10). Osana tätä projektia verkkoproteomiikasta on tullut lupaava työkalu systeemipohjaisten biomarkkerien kehittämiseen AD:ssa. Tämä puolueeton datalähtöinen lähestymistapa järjestää monimutkaiset proteomiikan tietojoukot yhdessä ilmentyneiden proteiinien ryhmiksi tai "moduuleiksi", jotka liittyvät tiettyihin solutyyppeihin, organelleihin ja biologisiin toimintoihin (11-13). Lähes 12 informaatiorikasta verkkoproteomiikkatutkimusta on suoritettu AD-aivoilla (13-23). Kaiken kaikkiaan nämä analyysit osoittavat, että AD-aivojen verkkoproteomi ylläpitää erittäin konservoitunutta modulaarista organisaatiota itsenäisissä kohorteissa ja useissa aivokuoren alueilla. Lisäksi jotkin näistä moduuleista osoittavat toistettavia muutoksia AD:hen liittyvässä runsaudessa eri tietosarjoissa, mikä heijastaa useiden sairauksien patofysiologiaa. Yhdessä nämä havainnot osoittavat lupaavan ankkuripisteen aivoverkon proteomin löytämiselle järjestelmäpohjaisena biomarkkerina AD:ssa.
Muuntaaksemme AD-aivoverkkoproteomin kliinisesti hyödyllisiksi järjestelmäpohjaisiksi biomarkkereiksi yhdistimme aivoista peräisin olevan verkon AD CSF:n proteomiseen analyysiin. Tämä integroitu lähestymistapa johti viiden lupaavan CSF-biomarkkerisarjan tunnistamiseen, jotka liittyvät monenlaiseen aivopohjaiseen patofysiologiaan, mukaan lukien synapsit, verisuonet, myelinaatio, tulehdus ja aineenvaihduntareittien toimintahäiriöt. Validoimme onnistuneesti nämä biomarkkeripaneelit useiden replikaatioanalyysien avulla, mukaan lukien yli 500 CSF-näytettä erilaisista neurodegeneratiivisista sairauksista. Näihin validointianalyyseihin kuuluu oireettoman AD:n (AsymAD) potilaiden aivo-selkäydinnesteessä olevien ryhmäkohteiden tutkiminen tai todisteiden osoittaminen epänormaalista amyloidin kertymisestä normaalissa kognitiivisessa ympäristössä. Nämä analyysit tuovat esiin merkittävän biologisen heterogeenisyyden AsymAD-populaatiossa ja tunnistavat paneelimarkkereita, jotka voivat kyetä alatyypistämään yksilöitä taudin varhaisimmista vaiheista. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset edustavat keskeistä askelta kehitettäessä proteiinien biomarkkerityökaluja, jotka perustuvat useisiin järjestelmiin, jotka voivat menestyksekkäästi ratkaista monia AD:n kohtaamista kliinisistä haasteista.
Tämän tutkimuksen päätarkoituksena on tunnistaa uusia aivo-selkäydinnesteen biomarkkereita, jotka heijastavat erilaisia aivopohjaisia patofysiologioita, jotka johtavat AD:hen. Kuva S1 esittelee tutkimusmetodologiamme, joka sisältää (i) kattavan analyysin, joka perustuu AD CSF:n alustaviin löydöksiin ja verkkoaivoproteomiin useiden aivoihin liittyvien CSF-sairauksien biomarkkereiden tunnistamiseksi, ja (ii) myöhemmän replikoinnin Nämä biomarkkerit ovat useissa itsenäisissä aivo-selkäydinkalvoissa. nestemäisiä kohortteja. Löytöihin suuntautunut tutkimus alkoi aivo-selkäydinnesteen erilaisen ilmentymisen analysoinnilla 20 kognitiivisesti normaalilla yksilöllä ja 20 AD-potilaalla Emory Goizuetan Alzheimerin taudin tutkimuskeskuksessa (ADRC). AD-diagnoosi määritellään merkittäväksi kognitiiviseksi heikkenemiseksi, kun aivo-selkäydinnesteessä on alhainen Aβ1-42 ja kohonneet kokonais-tau- ja p-tau-tasot [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (taulukko S1A). Kontrollissa (keskimääräinen MoCA, 26,7 ± 2,2) oli normaalit CSF-biomarkkerit.
Ihmisen CSF:lle on ominaista dynaaminen proteiinien runsausalue, jossa albumiini ja muut erittäin runsaat proteiinit voivat estää kiinnostavien proteiinien havaitsemisen (24). Proteiinien löytämisen syvyyden lisäämiseksi poistimme ensimmäiset 14 erittäin runsasta proteiinia jokaisesta CSF-näytteestä ennen massaspektrometria (MS) analyysiä (24). MS tunnisti yhteensä 39 805 peptidiä, jotka kartoitettiin 3691 proteomiin 40 näytteessä. Proteiinin kvantifiointi suoritetaan usealla tandemmassatunnisteella (TMT) -leimauksella (18, 25). Puuttuvien tietojen ratkaisemiseksi sisällytimme vain ne proteiinit, jotka kvantifioitiin vähintään 50 %:ssa näytteistä myöhemmässä analyysissä, mikä lopulta määritti 2875 proteomia. Kokonaisproteiinin runsaustasojen merkittävän eron vuoksi kontrollinäytettä pidettiin tilastollisesti poikkeavana arvona (13), eikä sitä sisällytetty myöhempään analyysiin. Jäljellä olevien 39 näytteen runsausarvot säädettiin iän, sukupuolen ja erän kovarianssin mukaan (13-15, 17, 18, 20, 26).
Käyttämällä tilastollista t-testianalyysiä differentiaalisen ilmentymisen arvioimiseksi regressiotietojoukossa, tämä analyysi tunnisti proteiinit, joiden runsaustasot muuttuivat merkittävästi (P <0,05) kontrolli- ja AD-tapausten välillä (taulukko S2A). Kuten kuviossa 1A esitetään, yhteensä 225 proteiinin runsaus AD:ssa väheni merkittävästi ja 303 proteiinin runsaus lisääntyi merkittävästi. Näihin eri tavalla ilmentyviin proteiineihin kuuluu useita aiemmin tunnistettuja aivo-selkäydinnesteen AD-markkereita, kuten mikrotubuluksiin liittyvä proteiini tau (MAPT; P = 3,52 × 10-8), neurofilamentti (NEFL; P = 6,56 × 10-3), kasvuun liittyvä proteiini 43 (GAP43; P = 1,46 × 10-5), rasvahappoja sitova proteiini 3 (FABP3; P = 2,00 × 10-5), kitinaasi 3:n kaltainen 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), hermogranuliini (NRGN; P = 3,43 × 10-4) ja VGF:n hermokasvutekijä (VGF; P = 4,83 × 10-3) (4-6). Tunnistimme kuitenkin myös muita erittäin tärkeitä kohteita, kuten GDP-dissosiaatio-inhibiittori 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) ja SPARCiin liittyvä modulaarinen kalsiumin sitoutuminen 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontology (GO) -analyysi 225 merkittävästi vähentyneestä proteiinista paljasti läheiset yhteydet kehon nesteprosesseihin, kuten steroidien aineenvaihduntaan, veren hyytymiseen ja hormoniaktiivisuuteen (kuva 1B ja taulukko S2B). Sitä vastoin 303:n merkittävästi lisääntynyt proteiini liittyy läheisesti solurakenteeseen ja energia-aineenvaihduntaan.
(A) Tulivuorikäyrä näyttää log2-kertaisen muutoksen (x-akseli) suhteessa -log10-tilastolliseen P-arvoon (y-akseli), joka on saatu t-testillä, jota käytetään havaitsemaan differentiaalinen ilmentyminen kontrollin (CT) ja välillä. Kaikkien proteiinien CSF-proteomin AD-tapaukset. Proteiinit, joiden tasot ovat merkittävästi vähentyneet (P <0,05) AD:ssa, on esitetty sinisellä, kun taas proteiinit, joiden taso on merkittävästi lisääntynyt sairaudessa, on esitetty punaisella. Valittu proteiini on leimattu. (B) Proteiiniin liittyvät suosituimmat GO-termit ovat merkittävästi vähentyneet (sininen) ja lisääntyneet (punainen) AD:ssa. Näyttää kolme GO-termiä, joilla on korkeimmat z-pisteet biologisten prosessien, molekyylitoimintojen ja solukomponenttien aloilla. (C) MS mittasi MAPT-tason CSF-näytteessä (vasemmalla) ja sen korrelaation näytteen ELISA-tau-tason kanssa (oikealla). Pearson-korrelaatiokerroin vastaavan P-arvon kanssa näytetään. Koska ELISA-tiedot puuttuvat yhdestä AD-tapauksesta, nämä luvut sisältävät arvot 38:lle 39 analysoidusta tapauksesta. (D) Valvottu klusterianalyysi (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) korjattu P <0,01) kontrollissa ja AD CSF:ssä löydettiin näytteitä käyttäen 65 eniten muuttunutta proteiinia tietojoukossa. Standardoi, normalisoi.
MAPT:n proteominen taso liittyy läheisesti itsenäisesti mitattuun ELISA-tau-tasoon (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; kuva 1C), mikä tukee MS-mittauksemme validiteettia. Amyloidiprekursoriproteiinin (APP) tasolla suoritetun trypsiinihajotuksen jälkeen Aβ1-40:n ja Aβ1-42:n C-päähän kartoitettuja isoformispesifisiä peptidejä ei voida ionisoida tehokkaasti (27, 28). Siksi tunnistamillamme APP-peptideillä ei ole mitään tekemistä ELISA Aβ1-42-tasojen kanssa. Arvioidaksemme kunkin tapauksen differentiaalista ilmentymistä käytimme eri tavalla ilmentyneitä proteiineja, joiden P <0,0001 [väärä havaitsemisnopeus (FDR) korjattu P <0,01] näytteiden valvotun klusterianalyysin suorittamiseksi (taulukko S2A). Kuten kuviosta 1D esitetään, nämä 65 erittäin merkittävää proteiinia voivat ryhmitellä näytteitä oikein sairauden tilan mukaan, paitsi yhtä AD-tapausta, jolla on kontrollin kaltaiset ominaisuudet. Näistä 65 proteiinista 63 lisääntyi AD:ssa, kun taas vain kaksi (CD74 ja ISLR) väheni. Kaiken kaikkiaan nämä aivo-selkäydinnesteanalyysit ovat tunnistaneet satoja proteiineja AD:ssa, jotka voivat toimia taudin biomarkkereina.
Sitten suoritimme riippumattoman verkkoanalyysin AD-aivoproteomista. Tämän löydön aivokohorttiin kuului dorsolateraalinen prefrontaalinen aivokuori (DLPFC) kontrollista (n = 10), Parkinsonin tauti (PD; n = 10), AD/PD (n = 10) ja AD (n = 10) sekatapaukset. ) Näyte. Emery Goizueta ADRC. Näiden 40 tapauksen demografiset tiedot on kuvattu aiemmin (25) ja niistä on yhteenveto taulukossa S1B. Käytimme TMT-MS:ää analysoimaan nämä 40 aivokudosta ja 27 tapauksen replikaatiokohortti. Yhteensä nämä kaksi aivotietosarjaa tuottivat 227 121 ainutlaatuista peptidiä, jotka kartoitettiin 12 943 proteomiin (25). Vain ne proteiinit, jotka määritettiin kvantitatiivisesti vähintään 50 %:ssa tapauksista, otettiin mukaan myöhemmissä tutkimuksissa. Lopullinen löytötietojoukko sisältää 8817 kvantifioitua proteiinia. Säädä proteiinien runsaustasoja iän, sukupuolen ja kuoleman jälkeisen intervallin (PMI) perusteella. Datasarjan differentiaalinen ilmentymisanalyysi regression jälkeen osoitti, että >2000 proteiinitasot muuttuivat merkittävästi [P <0,05, varianssianalyysi (ANOVA)] kahdessa tai useammassa sairauskohortissa. Sitten suoritimme valvotun klusterianalyysin, joka perustui differentiaalisesti ilmentyneisiin proteiineihin ja P <0,0001:een AD/kontrolli- ja/tai AD/PD-vertailuissa (kuvio S2, A ja B, taulukko S2C). Nämä 165 voimakkaasti muuttunutta proteiinia kuvaavat selvästi tapauksia, joissa on AD-patologia kontrolli- ja PD-näytteistä, mikä vahvistaa vahvat AD-spesifiset muutokset koko proteomissa.
Sitten käytimme algoritmia nimeltä Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) verkkoanalyysin tekemiseen löydetylle aivoproteomille, joka järjestää datajoukon proteiinimoduuleiksi, joilla on samanlaiset ilmentymismallit (11-13). Analyysi identifioi 44 moduulia (M) ko-ilmentyvää proteiinia, lajiteltuina ja numeroituina suurimmista (M1, n = 1821 proteiinia) pienimpiin (M44, n = 34 proteiinia) (kuvio 2A ja taulukko S2D)). Kuten edellä mainittiin (13) Laske kunkin moduulin edustava ilmentymisprofiili tai ominaisproteiini ja korreloi se sairauden tilan ja AD-patologian kanssa, eli määritä Alzheimerin taudin rekisterin (CERAD) ja Braakin pistemäärän liitto (kuva 2B). Kaiken kaikkiaan 17 moduulia liittyi merkitsevästi AD-neuropatologiaan (P <0,05). Monet näistä sairauteen liittyvistä moduuleista sisältävät myös runsaasti solutyyppispesifisiä markkereita (kuvio 2B). Kuten edellä mainittiin (13), solutyypin rikastuminen määritetään analysoimalla moduulien päällekkäisyys ja solutyyppispesifisten geenien viiteluettelo. Nämä geenit ovat peräisin julkaistuista tiedoista eristetyissä hiiren neuroneissa, endoteelisoluissa ja gliasoluissa. RNA-sekvensointikoe (RNA-seq) (29).
(A) Löydä aivojen proteomin WGCNA. (B) Modulaarisen allekirjoitusproteiinin (modulaarisen proteiinin ilmentymisen ensimmäinen pääkomponentti) kaksipainokeskikorrelaatioanalyysi (BiCor) AD-neuropatologisilla ominaisuuksilla (ylhäällä), mukaan lukien CERAD (Aβ plakki) ja Braak (tau tangles) -pisteet. Positiivisten (punainen) ja negatiivisten (sininen) korrelaatioiden intensiteetit on esitetty kaksivärisellä lämpökartalla, ja tähdet osoittavat tilastollista merkitsevyyttä (P <0,05). Käytä hypergeometristä Fisherin tarkkaa testiä (FET) (alhaalla) kunkin proteiinimoduulin solutyyppiyhdistyksen arvioimiseen. Punaisen varjostuksen intensiteetti osoittaa solutyypin rikastumisen astetta ja tähti osoittaa tilastollista merkitsevyyttä (P <0,05). Käytä BH-menetelmää FET:stä johdetun P-arvon korjaamiseen. (C) Modulaaristen proteiinien GO-analyysi. Lähinnä toisiinsa liittyvät biologiset prosessit esitetään jokaiselle moduulille tai siihen liittyvälle moduuliryhmälle. oligo, oligodendrosyytti.
Viiden läheisesti sukua olevan astrosyytti- ja mikroglia-rikkaan moduulin sarja (M30, M29, M18, M24 ja M5) osoitti vahvan positiivisen korrelaation AD-neuropatologian kanssa (kuvio 2B). Ontologia-analyysi yhdistää nämä gliamoduulit solujen kasvuun, lisääntymiseen ja immuniteettiin (kuva 2C ja taulukko S2E). Kaksi muuta gliamoduulia, M8 ja M22, ovat myös voimakkaasti säädeltyjä sairaudessa. M8 on vahvasti sukua Toll-tyyppiseen reseptorireittiin, signalointikaskadiin, jolla on keskeinen rooli synnynnäisessä immuunivasteessa (30). Samaan aikaan M22 liittyy läheisesti translaation jälkeiseen modifikaatioon. M2, jossa on runsaasti oligodendrosyyttejä, osoittaa vahvan positiivisen korrelaation AD-patologian kanssa ja ontologista yhteyttä nukleosidisynteesiin ja DNA:n replikaatioon, mikä osoittaa lisääntynyttä solujen lisääntymistä sairauksissa. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot tukevat gliamoduulien nousua, jonka olemme aiemmin havainneet AD-verkon proteomissa (13, 17). Tällä hetkellä havaitaan, että monilla AD:hen liittyvillä gliamoduuleilla verkossa on alhaisemmat ekspressiotasot kontrolli- ja PD-tapauksissa, mikä korostaa niiden sairausspesifisyyttä, joka on kohonnut AD:ssa (kuva S2C).
Vain neljä verkkoproteomissamme olevaa moduulia (M1, M3, M10 ja M32) korreloi voimakkaasti negatiivisesti AD-patologian kanssa (P <0,05) (kuva 2, B ja C). Sekä M1 että M3 sisältävät runsaasti hermosolumarkkereita. M1 liittyy vahvasti synaptisiin signaaleihin, kun taas M3 liittyy läheisesti mitokondrioiden toimintaan. M10:n ja M32:n solutyypin rikastumisesta ei ole näyttöä. M32 heijastaa yhteyttä M3:n ja soluaineenvaihdunnan välillä, kun taas M10 liittyy vahvasti solujen kasvuun ja mikrotubulusten toimintaan. Verrattuna AD:hen, kaikki neljä moduulia ovat lisääntyneet kontrollissa ja PD:ssä, mikä antaa niille sairauskohtaisia AD-muutoksia (kuva S2C). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat vähentynyttä hermosolujen rikkaiden moduulien määrää, joita olemme aiemmin havainneet AD:ssa (13, 17). Yhteenvetona voidaan todeta, että löytämämme aivojen proteomin verkkoanalyysi tuotti AD-spesifisesti muunneltuja moduuleja, jotka ovat yhdenmukaisia aiempien löydöstemme kanssa.
AD:lle on ominaista varhainen oireeton vaihe (AsymAD), jossa yksilöillä on amyloidin kertymistä ilman kliinistä kognitiivista heikkenemistä (5, 31). Tämä oireeton vaihe on kriittinen ikkuna varhaiselle havaitsemiselle ja puuttumiselle. Olemme aiemmin osoittaneet vahvan modulaarisen AsymAD- ja AD-aivoverkon proteomin säilymisen riippumattomissa tietosarjoissa (13, 17). Varmistaaksemme, että tällä hetkellä löytämämme aivoverkosto on yhdenmukainen näiden aikaisempien havaintojen kanssa, analysoimme 44 moduulin säilymisen 27 DLPFC-organisaation replikoidussa tietojoukossa. Näihin organisaatioihin kuuluvat kontrolli- (n = 10), AsymAD (n = 8) ja AD (n = 9) tapaukset. Kontrolli- ja AD-näytteet sisällytettiin löytöaivokohorttimme analyysiin (taulukko S1B), kun taas AsymAD-tapaukset olivat ainutlaatuisia vain replikaatiokohortissa. Nämä AsymAD-tapaukset tulivat myös Emory Goizuetan ADRC-aivopankista. Vaikka kognitio oli normaalia kuolinhetkellä, amyloiditasot olivat epänormaalin korkeat (keskimääräinen CERAD, 2,8 ± 0,5) (taulukko S1B).
Näiden 27 aivokudoksen TMT-MS-analyysi johti 11 244 proteomin kvantifiointiin. Tämä lopullinen määrä sisältää vain ne proteiinit, jotka on kvantifioitu vähintään 50 %:ssa näytteistä. Tämä replikoitu tietojoukko sisältää 8 638 (98,0 %) löytöaivoanalyysissämme havaituista 8 817 proteiinista, ja siinä on lähes 3 000 merkittävästi muuttunutta proteiinia kontrolli- ja AD-kohortin välillä (P <0,05, Tukeyn varianssianalyysin parillisen t-testin jälkeen) ( Taulukko S2F). Näiden erilailla ilmentyneiden proteiinien joukossa 910 osoitti myös merkittäviä tasomuutoksia AD- ja aivojen proteomikontrollitapausten välillä (P <0,05, ANOVA Tukeyn parillisen t-testin jälkeen). On syytä huomata, että nämä 910-markkerit ovat erittäin yhdenmukaisia proteomien välisen muutoksen suunnassa (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (kuva S3A). Lisääntyneiden proteiinien joukossa proteiinit, joilla on johdonmukaisimmat muutokset tietosarjojen välillä, ovat pääasiassa gliarikkaiden M5- ja M18-moduulien jäseniä (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 ja GFAP). Vähennettyjen proteiinien joukossa ne, joilla oli johdonmukaisimmat muutokset, olivat lähes yksinomaan M1-moduulin jäseniä (NPTX2, VGF ja RPH3A), jotka liittyvät synapsiin. Vahvistimme edelleen AD:hen liittyvät muutokset midkinen (MDK), CD44:n, erittyneen frizzled-sukuisen proteiinin 1:n (SFRP1) ja VGF:n välillä Western blot -menetelmällä (kuva S3B). Moduulien säilyvyysanalyysi osoitti, että noin 80 % aivojen proteomin proteiinimoduuleista (34/44) oli merkittävästi konservoituneita replikaatiotietojoukossa (z-pistemäärä> 1,96, FDR-korjattu P <0,05) (kuvio S3C). Neljätoista näistä moduuleista oli erityisesti varattu kahden proteomin väliin (z-pisteet> 10, FDR-korjattu P <1,0 × 10-23). Kaiken kaikkiaan aivojen proteomin välisen differentiaalisen ilmentymisen ja modulaarisen koostumuksen korkean yhdenmukaisuuden löytäminen ja replikaatio korostaa AD:n etukuoren proteiinien muutosten toistettavuutta. Lisäksi se vahvisti myös, että AsymAD:lla ja kehittyneemmillä sairauksilla on hyvin samanlainen aivoverkostorakenne.
Yksityiskohtaisempi analyysi differentiaalista ilmentymisestä aivojen replikaatiotietojoukossa korostaa AsymAD-proteiinin muutosten merkittävää astetta, mukaan lukien yhteensä 151 merkittävästi muuttunutta proteiinia AsymAD:n ja kontrollin välillä (P <0,05) (kuva S3D). Amyloidikuorman mukaisesti APP AsymAD:n ja AD:n aivoissa lisääntyi merkittävästi. MAPT muuttuu vain merkittävästi AD:ssa, mikä on sopusoinnussa lisääntyneiden sotkujen kanssa ja sen tunnetun korrelaation kanssa kognitiivisen heikkenemisen kanssa (5, 7). Runsaasti gliamoduulit (M5 ja M18) heijastuvat voimakkaasti AsymAD:n lisääntyneisiin proteiineihin, kun taas hermosoluihin liittyvä M1-moduuli edustaa AsymAD:n vähentyneitä proteiineja. Monet näistä AsymAD-markkereista osoittavat suurempia muutoksia oireellisissa sairauksissa. Näihin markkereihin kuuluu SMOC1, M18:aan kuuluva gliaproteiini, joka liittyy aivokasvainten sekä silmien ja raajojen kehittymiseen (32). MDK on hepariinia sitova kasvutekijä, joka liittyy solujen kasvuun ja angiogeneesiin (33), toinen M18:n jäsen. Verrokkiryhmään verrattuna AsymAD lisääntyi merkittävästi, mitä seurasi suurempi AD lisääntyminen. Sitä vastoin synaptinen proteiini neuropentraksiini 2 (NPTX2) väheni merkittävästi AsymAD-aivoissa. NPTX2 yhdistettiin aiemmin hermoston rappeutumiseen, ja sillä on tunnustettu rooli kiihottavien synapsien välittäjänä (34). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset paljastavat monia erilaisia prekliinisiä proteiinimuutoksia AD:ssa, jotka näyttävät etenevän taudin vaikeusasteen mukaan.
Ottaen huomioon, että olemme saavuttaneet merkittävän syvyyden proteiinikattavuuden aivojen proteomin löytämisessä, yritämme ymmärtää paremmin sen päällekkäisyyttä verkkotason AD-transkriptin kanssa. Siksi vertailimme löytämäämme aivoproteomia moduuliin, jonka loimme aiemmin 18 204 geenin microarray-mittauksella AD (n = 308) ja kontrolli (n = 157) DLPFC-kudoksissa (13). päällekkäin. Kaiken kaikkiaan tunnistimme 20 erilaista RNA-moduulia, joista monet osoittivat tiettyjen solutyyppien, mukaan lukien hermosolujen, oligodendrosyytit, astrosyytit ja mikrogliat, rikastumista (kuva 3A). Näiden moduulien useat muutokset AD:ssa on esitetty kuvassa 3B. Aiemman proteiini-RNA-päällekkäisyysanalyysimme mukaisesti käyttämällä syvempää leimaamatonta MS-proteomia (noin 3000 proteiinia) (13), suurin osa aivojen proteomiverkoston 44 moduulista, jotka löysimme, ovat transkriptioverkostossa. Merkittävää päällekkäisyyttä ei ole. löytömme ja 34 proteiinimoduulin replikaatio, jotka säilyvät voimakkaasti aivojen proteomissa, vain 14 (~ 40 %) läpäisi Fisherin tarkan testin (FET) osoittautui tilastollisesti merkitseväksi päällekkäisyydellä transkriptomin kanssa (kuva 3A). Yhteensopiva DNA-vaurion korjauksen (P-M25 ja P-M19), proteiinin translaation (P-M7 ja P-M20), RNA:n sitoutumisen/silmukoinnin (P-M16 ja P-M21) ja proteiinikohdistuksen (P-M13 ja P-) kanssa. M23) ei mene päällekkäin transkriptin moduulien kanssa. Siksi, vaikka nykyisessä päällekkäisyysanalyysissä (13) käytetään syvempää proteomitietojoukkoa, suurinta osaa AD-verkon proteomista ei ole kartoitettu transkriptiverkkoon.
(A) Hypergeometrinen FET osoittaa solutyyppispesifisten markkerien rikastumisen AD-transkriptin RNA-moduulissa (ylhäällä) ja päällekkäisyyden asteen AD-aivojen RNA- (x-akseli) ja proteiini (y-akseli) -moduulien välillä. (alhaalla). Punaisen varjostuksen voimakkuus osoittaa yläpaneelin solutyyppien rikastumisasteen ja alapaneelin moduulien päällekkäisyyden voimakkuuden. Tähdet osoittavat tilastollista merkitsevyyttä (P <0,05). (B) Korrelaatioaste kunkin transkriptimoduulin tunnusomaisten geenien ja AD-tilan välillä. Vasemmalla olevat moduulit korreloivat negatiivisimmin AD:n kanssa (sininen) ja oikealla olevat moduulit korreloivat positiivisimmin AD:n kanssa (punainen). Log-muunnettu BH-korjattu P-arvo ilmaisee kunkin korrelaation tilastollisen merkitsevyyden asteen. (C) Merkittävät päällekkäiset moduulit jaetulla solutyypin rikastuksella. (D) Leimatun proteiinin (x-akseli) ja RNA:n (y-akseli) log2-kertaisen muutoksen korrelaatioanalyysi limittyvässä moduulissa. Pearson-korrelaatiokerroin vastaavan P-arvon kanssa näytetään. mikro, mikroglia; taivaankappaleet, astrosyytit. CT, ohjaus.
Useimmilla päällekkäisillä proteiini- ja RNA-moduuleilla on samanlaiset solutyypin rikastumisprofiilit ja johdonmukaiset AD-muutossuunnat (kuvio 3, B ja C). Toisin sanoen aivojen proteomin synapsiin liittyvä M1-moduuli (PM1) on kartoitettu kolmeen hermosoluja sisältävään homologiseen RNA-moduuliin (R-M1, R-M9 ja R-M16), jotka ovat AD:ssa. Molemmat osoittivat. alennettu taso. Samoin gliarikkaat M5- ja M18-proteiinimoduulit menevät päällekkäin sellaisten RNA-moduulien kanssa, joissa on runsaasti astrosyyttejä ja mikrogliamarkkereita (R-M3, R-M7 ja R-M10), ja ne ovat erittäin mukana sairauksissa. Nämä jaetut modulaariset ominaisuudet kahden tietojoukon välillä tukevat edelleen solutyypin rikastumista ja sairauksiin liittyviä muutoksia, joita olemme havainneet aivojen proteomissa. Havaitsimme kuitenkin monia merkittäviä eroja yksittäisten markkerien RNA- ja proteiinitasojen välillä näissä jaetuissa moduuleissa. Näiden päällekkäisten moduulien sisällä olevien molekyylien proteomiikan ja transkriptomiikan differentiaalisen ilmentymisen korrelaatioanalyysi (kuva 3D) korostaa tätä epäjohdonmukaisuutta. Esimerkiksi APP ja useat muut gliamoduuliproteiinit (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 ja SFRP1) osoittivat merkittävää lisäystä AD-proteomissa, mutta AD-transkriptomissa ei ollut juuri mitään muutosta. Nämä proteiinispesifiset muutokset voivat liittyä läheisesti amyloidiplakkeihin (23, 35), mikä korostaa proteomin patologisten muutosten lähteenä, eivätkä nämä muutokset välttämättä heijastu transkriptomiin.
Analysoituamme itsenäisesti löytämämme aivot ja CSF-proteomit, teimme kattavan analyysin kahdesta tietojoukosta tunnistaaksemme AD CSF-biomarkkerit, jotka liittyvät aivoverkoston patofysiologiaan. Meidän on ensin määritettävä kahden proteomin päällekkäisyys. Vaikka on yleisesti hyväksyttyä, että CSF heijastaa neurokemiallisia muutoksia AD-aivoissa (4), AD-aivojen ja CSF-proteomin tarkka päällekkäisyysaste on epäselvä. Vertaamalla kahdessa proteomissamme havaittujen yhteisten geenituotteiden määrää, havaitsimme, että lähes 70 % (n = 1936) aivo-selkäydinnesteestä tunnistetuista proteiineista oli myös kvantifioitu aivoissa (kuvio 4A). Suurin osa näistä päällekkäisistä proteiineista (n = 1721) on kartoitettu yhteen 44 yhteisilmentymismoduulista löytöaivojen tietojoukosta (kuva 4B). Kuten odotettiin, kuusi suurinta aivomoduulia (M1 - M6) osoittivat eniten CSF-päällekkäisyyttä. On kuitenkin pienempiä aivomoduuleja (esimerkiksi M15 ja M29), jotka saavuttavat odottamattoman suuren päällekkäisyyden, suurempi kuin kaksi kertaa sen kokoinen aivomoduuli. Tämä motivoi meitä ottamaan käyttöön yksityiskohtaisemman, tilastollisesti ohjatun menetelmän aivojen ja aivo-selkäydinnesteen päällekkäisyyden laskemiseksi.
(A ja B) Löytöaivojen ja CSF-tietosarjoissa havaitut proteiinit menevät päällekkäin. Suurin osa näistä päällekkäisistä proteiineista liittyy yhteen aivojen yhteisilmentymisverkoston 44 yhteisilmentymismoduulista. (C) Löydä päällekkäisyys aivo-selkäydinnesteen proteomin ja aivoverkon proteomin välillä. Jokainen lämpökartan rivi edustaa hypergeometrisen FET:n erillistä päällekkäisanalyysiä. Ylärivi kuvaa päällekkäisyyttä (harmaa/musta varjostus) aivomoduulin ja koko CSF-proteomin välillä. Toinen viiva kuvaa, että aivomoduulien ja CSF-proteiinin (punaisella varjostettu) päällekkäisyys on merkittävästi ylöspäin säädelty AD:ssa (P <0,05). Kolmas rivi osoittaa, että aivomoduulien ja CSF-proteiinin (sininen varjostus) päällekkäisyys on merkittävästi alasäädelty AD:ssa (P <0,05). Käytä BH-menetelmää FET:stä johdetun P-arvon korjaamiseen. (D) Taitettava moduulipaneeli, joka perustuu solutyyppiyhdistykseen ja siihen liittyviin GO-termeihin. Nämä paneelit sisältävät yhteensä 271 aivoihin liittyvää proteiinia, joilla on merkityksellinen erilainen ekspressio CSF-proteomissa.
Yksisuuntaisia FETejä käyttämällä arvioimme proteiinien päällekkäisyyden tärkeyden CSF-proteomin ja yksittäisten aivomoduulien välillä. Analyysi paljasti, että yhteensä 14 aivomoduulilla CSF-aineistossa on tilastollisesti merkitseviä päällekkäisyyksiä (FDR-korjattu P <0,05) ja lisämoduuli (M18), jonka päällekkäisyys on lähellä merkitsevyyttä (FDR-korjattu P = 0,06) (Kuva 4C , ylärivi). Olemme myös kiinnostuneita moduuleista, jotka menevät vahvasti päällekkäin eri tavalla ilmentyneiden CSF-proteiinien kanssa. Siksi käytimme kahta FET-lisäanalyysiä määrittääksemme, mikä seuraavista: (i) CSF-proteiini lisääntyi merkitsevästi AD:ssa ja (ii) CSF-proteiini väheni merkittävästi AD:ssa (P <0,05, parillinen t-testi AD/kontrolli) Aivomoduuleista, joilla oli merkittävä päällekkäisyys heidän välillään. Kuten kuvan 4C keski- ja alarivillä näkyy, nämä lisäanalyysit osoittavat, että 8 44 aivomoduulista on merkittävästi päällekkäin AD CSF:ään lisätyn proteiinin kanssa (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 ja M38). . ), kun taas vain kaksi moduulia (M6 ja M15) osoitti merkittävää päällekkäisyyttä AD-CSF:n vähentyneen proteiinin kanssa. Kuten odotettiin, kaikki 10 moduulia ovat 15 moduulissa, joilla on suurin päällekkäisyys CSF-proteomin kanssa. Siksi oletamme, että nämä 15 moduulia ovat korkeatuottoisia AD-aivoperäisten CSF-biomarkkereiden lähteitä.
Taitimme nämä 15 päällekkäistä moduulia viiteen suureen proteiinipaneeliin perustuen niiden läheisyyteen WGCNA-puukaaviossa ja niiden assosiaatioon solutyyppien ja geeniontologian kanssa (kuva 4D). Ensimmäinen paneeli sisältää moduuleita, jotka sisältävät runsaasti hermosolumarkkereita ja synapsiin liittyviä proteiineja (M1 ja M12). Synaptinen paneeli sisältää yhteensä 94 proteiinia, ja CSF-proteomin tasot ovat muuttuneet merkittävästi, mikä tekee siitä suurimman aivoihin liittyvien CSF-markkereiden lähteen viiden paneelin joukossa. Toinen ryhmä (M6 ja M15) osoitti läheisen yhteyden endoteelisolumarkkereihin ja verisuonirunkoon, kuten "haavan paranemiseen" (M6) ja "humoraalisen immuunivasteen säätelyyn" (M15). M15 liittyy myös vahvasti lipoproteiinien aineenvaihduntaan, joka liittyy läheisesti endoteeliin (36). Verisuonipaneeli sisältää 34 aivoihin liittyvää CSF-markkeria. Kolmanteen ryhmään kuuluvat moduulit (M2 ja M4), jotka liittyvät merkittävästi oligodendrosyyttimarkkereihin ja solujen lisääntymiseen. Esimerkiksi M2:n huipputason ontologiatermejä ovat "DNA:n replikaation positiivinen säätely" ja "puriinien biosynteesiprosessi". Samaan aikaan M4:n oireisiin kuuluvat "gliasolujen erilaistuminen" ja "kromosomien segregaatio". Myelinaatiopaneeli sisältää 49 aivoihin liittyvää CSF-markkeria.
Neljännessä ryhmässä on eniten moduuleja (M30, M29, M18, M24 ja M5), ja lähes kaikissa moduuleissa on merkittävästi runsaasti mikroglia- ja astrosyyttimarkkereita. Myelinaatiopaneelin tapaan neljäs paneeli sisältää myös moduuleja (M30, M29 ja M18), jotka liittyvät läheisesti solujen lisääntymiseen. Muut tämän ryhmän moduulit liittyvät vahvasti immunologisiin termeihin, kuten "immuunivaikutusprosessi" (M5) ja "immuunivasteen säätely" (M24). Glia-immuuniryhmä sisältää 42 aivoihin liittyvää CSF-markkeria. Lopuksi viimeinen paneeli sisältää 52 aivoihin liittyvää merkkiä neljässä moduulissa (M44, M3, M33 ja M38), jotka kaikki ovat kehossa, jotka liittyvät energian varastointiin ja aineenvaihduntaan. Suurin näistä moduuleista (M3) on läheistä sukua mitokondrioille ja sisältää runsaasti neuronispesifisiä markkereita. M38 on yksi tämän metabolomin pienimmistä moduulin jäsenistä ja sillä on myös kohtalainen hermospesifisyys.
Kaiken kaikkiaan nämä viisi paneelia heijastavat laajaa valikoimaa solutyyppejä ja toimintoja AD-kuoressa ja sisältävät yhdessä 271 aivoihin liittyvää CSF-markkeria (taulukko S2G). Näiden MS-tulosten validiteetin arvioimiseksi käytimme läheisyyslaajennusmääritystä (PEA), ortogonaaliseen vasta-ainepohjaista teknologiaa, jolla on multipleksointikyky, korkea herkkyys ja spesifisyys, ja analysoidaan uudelleen aivo-selkäydinnestenäytteet, jotka löysimme Osajoukon näistä 271 biomarkkerista. (n = 36). Nämä 36 kohdetta osoittavat muutoksen PEA:n AD-kertoimessa, mikä liittyy läheisesti MS-pohjaisiin löydöksiimme (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), mikä vahvisti vahvasti kattavan MS-analyysimme tulokset (kuva S4). ).
Viiden ryhmämme painottamat biologiset teemat synaptisesta signaloinnista energia-aineenvaihduntaan liittyvät kaikki AD:n patogeneesiin (1-3). Siksi kaikki 15 moduulia, jotka sisältävät nämä paneelit, liittyvät AD-patologiaan aivojen proteomissa, jonka löysimme (kuva 2B). Merkittävin on korkea positiivinen patologinen korrelaatio gliamoduuliemme välillä ja voimakas negatiivinen patologinen korrelaatio suurimpien neuronaalisten moduuliemme (M1 ja M3) välillä. Replikoituneen aivoproteoomimme differentiaalinen ilmentymisanalyysi (kuva S3D) korostaa myös M5- ja M18-peräisiä gliaproteiineja. AsymAD:ssa ja oireellisessa AD:ssa eniten lisääntyneet gliaproteiinit ja M1:een liittyvät synapsit Proteiini vähenee eniten. Nämä havainnot osoittavat, että viidestä ryhmästä tunnistamamme 271 aivo-selkäydinnestemarkkeria liittyvät AD-kuoren sairausprosesseihin, mukaan lukien ne, jotka esiintyvät varhaisissa oireettomissa vaiheissa.
Jotta voitaisiin paremmin analysoida paneeliproteiinien muutossuunnan aivoissa ja selkäydinnesteessä, piirsimme seuraavat kullekin 15 päällekkäiselle moduulille: (i) löysimme moduulien runsaustason aivotietojoukosta ja (ii) moduulin. proteiini Ero ilmaistaan aivo-selkäydinnesteessä (kuva S5). Kuten aiemmin mainittiin, WGCNA:ta käytetään määrittämään moduulien runsaus tai tyypillinen proteiiniarvo aivoissa (13). Tulivuoren karttaa käytetään kuvaamaan modulaaristen proteiinien erilaista ilmentymistä aivo-selkäydinnesteessä (AD/kontrolli). Nämä luvut osoittavat, että kolme viidestä paneelista osoittavat erilaisia ilmentymistrendejä aivoissa ja selkäydinnesteessä. Synapsipaneelin kaksi moduulia (M1 ja M12) osoittavat AD-aivojen runsaustason laskua, mutta ovat merkittävästi päällekkäisiä AD-CSF:n lisääntyneen proteiinin kanssa (kuva S5A). Neuroneihin liittyvät moduulit, jotka sisälsivät metabolomin (M3 ja M38), osoittivat samanlaisia aivo- ja selkäydinnesteen ilmentymismalleja, jotka olivat epäjohdonmukaisia (kuva S5E). Verisuonipaneeli osoitti myös erilaisia ilmentymistrendejä, vaikka sen moduulit (M6 ja M15) lisääntyivät kohtalaisesti AD-aivoissa ja vähenivät sairaassa CSF:ssä (kuvio S5B). Loput kaksi paneelia sisältävät suuria gliaverkkoja, joiden proteiinit ovat johdonmukaisesti ylössäädelty molemmissa osastoissa (kuva S5, C ja D).
Huomaa, että nämä trendit eivät ole yhteisiä kaikille näissä paneeleissa oleville merkeille. Esimerkiksi synaptinen paneeli sisältää useita proteiineja, jotka ovat merkittävästi vähentyneet AD-aivoissa ja CSF:ssä (kuvio S5A). Näihin alassäänneltyihin aivo-selkäydinnesteen markkereihin kuuluvat M1:n NPTX2 ja VGF sekä M12:n kromograniini B. Näistä poikkeuksista huolimatta suurin osa synaptisista markkereistamme on kohonnut AD-selkäydinnesteessä. Kaiken kaikkiaan nämä analyysit pystyivät erottamaan tilastollisesti merkittävät suuntaukset aivojen ja aivo-selkäydinnesteen tasoissa jokaisessa viidestä paneelistamme. Nämä suuntaukset korostavat monimutkaista ja usein erilaista suhdetta aivojen ja CSF-proteiinin ilmentymisen välillä AD:ssa.
Sitten käytimme korkean suorituskyvyn MS-replikaatioanalyysiä (CSF-replikaatio 1) rajataksemme 271 biomarkkerimme lupaavimpiin ja toistettavimpiin kohteisiin (kuva 5A). CSF-kopio 1 sisältää yhteensä 96 näytettä Emory Goizueta ADRC:stä, mukaan lukien kontrolli, AsymAD ja AD-kohortti (taulukko S1A). Näille AD-tapauksille on ominaista lievä kognitiivinen heikkeneminen (keskimääräinen MoCA, 20,0 ± 3,8) ja muutokset AD-biomarkkereissa, jotka on vahvistettu aivo-selkäydinnesteessä (taulukko S1A). Toisin kuin löytämämme CSF-analyysi, tämä replikointi suoritetaan käyttämällä tehokkaampaa ja tehokkaampaa "single-shot" MS-menetelmää (ilman off-line-fraktiointia), mukaan lukien yksinkertaistettu näytteenvalmistusprotokolla, joka eliminoi yksittäisten näytteiden immuunipuutoksen tarpeen. . Sen sijaan yhtä immuunipuutteista "tehostuskanavaa" käytetään vahvistamaan vähemmän runsaiden proteiinien signaalia (37). Vaikka se vähentää proteomin kokonaispeittoa, tämä yhden laukauksen menetelmä vähentää merkittävästi koneen aikaa ja lisää TMT-leimattujen näytteiden määrää, jotka voidaan analysoida elinkelpoisiksi (17, 38). Kaiken kaikkiaan analyysi tunnisti 6 487 peptidiä, jotka kartoitettiin 1 183 proteomiin 96 tapauksessa. Kuten havaitsemamme CSF-analyysissä, vain ne proteiinit, jotka oli kvantifioitu vähintään 50 %:ssa näytteistä, sisällytettiin seuraaviin laskelmiin, ja tiedot regressoitiin iän ja sukupuolen vaikutuksista. Tämä johti 792 proteomin lopulliseen kvantifiointiin, joista 95 % tunnistettiin myös löydetyssä CSF-tietojoukossa.
(A) Aivoihin liittyvät CSF-proteiinikohteet varmistettiin ensimmäisessä replikoituneessa CSF-kohortissa ja sisällytettiin lopulliseen paneeliin (n = 60). (B–E) Paneelin biomarkkeritasot (yhdistetyt z-pisteet) mitattuna neljässä CSF-replikaatiokohortissa. Parillisia t-testejä tai ANOVAa Tukeyn jälkikorjauksella käytettiin arvioimaan runsauden muutosten tilastollista merkitsevyyttä kussakin rinnakkaisanalyysissä. CT, ohjaus.
Koska olemme erityisen kiinnostuneita vahvistamaan 271 aivoihin liittyvää CSF-kohdetta kattavan analyysin avulla, rajoitamme tämän replikoituneen proteomin jatkotutkimuksen näihin markkereihin. Näistä 271 proteiinista 100 havaittiin CSF:n replikaatiossa 1. Kuvio S6A esittää näiden 100 päällekkäisen markkerin erilaista ilmentymistä kontrolli- ja AD-replikaationäytteiden välillä. Synaptiset ja metaboliittihistonet lisääntyvät eniten AD:ssa, kun taas verisuonten proteiinit vähenevät eniten sairaudessa. Suurin osa 100 päällekkäisestä markkerista (n = 70) säilytti saman muutoksen suunnan kahdessa tietojoukossa (kuva S6B). Nämä 70 validoitua aivoihin liittyvää CSF-markkeria (taulukko S2H) heijastavat suurelta osin aiemmin havaittuja paneelin ilmentymistrendejä, toisin sanoen verisuoniproteiinien alasäätelyä ja kaikkien muiden paneelien ylössäätelyä. Vain 10 näistä 70 validoidusta proteiinista osoitti muutoksia AD:n runsaudessa, jotka olivat ristiriidassa näiden paneelitrendien kanssa. Luodaksemme paneelin, joka heijastaa parhaiten aivojen ja aivo-selkäydinnesteen yleistä suuntausta, poistimme nämä 10 proteiinia kiinnostavasta paneelista, jonka lopulta vahvistimme (kuva 5A). Siksi paneelimme sisältää lopulta yhteensä 60 proteiinia, jotka on varmistettu kahdessa riippumattomassa CSF AD -kohortissa käyttämällä erilaista näytteen valmistelua ja MS-alustan analyysiä. Näiden lopullisten paneelien z-pisteiden ilmentymiskäyrät CSF-kopion 1 kontrolli- ja AD-tapauksissa vahvistivat löytämämme CSF-kohortissa havaitun paneelitrendin (kuvio 5B).
Näiden 60 proteiinin joukossa on molekyylejä, joiden tiedetään liittyvän AD:hen, kuten osteopontiini (SPP1), joka on tulehdusta edistävä sytokiini, joka on yhdistetty AD:hen monissa tutkimuksissa (39-41), ja GAP43, synaptinen A-proteiini. joka liittyy selvästi hermoston rappeutumiseen (42). Täydellisimmät proteiinit ovat markkereita, jotka liittyvät muihin neurodegeneratiivisiin sairauksiin, kuten amyotrofiseen lateraaliskleroosiin (ALS) liittyvä superoksididismutaasi 1 (SOD1) ja Parkinsonin tautiin liittyvä desakkaraasi (PARK7). Olemme myös varmistaneet, että monilla muilla markkereilla, kuten SMOC1 ja aivorikas kalvokiinnityssignaaliproteiini 1 (BASP1), on rajoitettu aikaisempia yhteyksiä hermoston rappeutumiseen. On syytä huomata, että niiden alhaisen yleisen runsauden vuoksi CSF-proteomissa meidän on vaikea käyttää tätä korkean suorituskyvyn yhden laukauksen havaitsemismenetelmää luotettavasti MAPT:n ja tiettyjen muiden AD:hen liittyvien proteiinien (esimerkiksi NEFL ja NRGN) havaitsemiseen. ) ( 43, 44).
Tarkastimme sitten nämä 60 prioriteettipaneelimerkkiä kolmessa lisäanalyysissä. CSF-kopiossa 2 käytimme yhtä TMT-MS:ää analysoimaan riippumaton kohortti 297 kontrolli- ja AD-näytteestä Emory Goizuetan ADRC:stä (17). CSF-replikaatio 3 sisälsi käytettävissä olevien TMT-MS-tietojen uudelleenanalyysin 120 kontrolli- ja AD-potilaalta Lausannesta, Sveitsistä (45). Havaitsimme yli kaksi kolmasosaa 60 prioriteettimerkistä kussakin tietojoukossa. Vaikka sveitsiläisessä tutkimuksessa käytettiin erilaisia MS-alustoja ja TMT-kvantifiointimenetelmiä (45, 46), toistimme vahvasti paneelitrendejämme kahdessa toistuvassa analyysissä (Kuva 5, C ja D sekä taulukot S2, I ja J). Arvioidaksemme ryhmämme sairausspesifisyyttä analysoimme TMT-MS:n avulla neljännen replikaatiodatajoukon (CSF-replikaatio 4), joka sisälsi kontrolli- (n = 18) ja AD (n = 17) tapausten lisäksi myös PD:n ( n = 14)), ALS- (n = 18) ja frontotemporaalisen dementian (FTD) näytteet (n = 11) (taulukko S1A). Kvantifioimme onnistuneesti lähes kaksi kolmasosaa tämän kohortin paneeliproteiineista (38/60). Nämä tulokset korostavat AD-spesifisiä muutoksia kaikissa viidessä biomarkkeripaneelissa (kuva 5E ja taulukko S2K). Metaboliittiryhmän lisääntyminen osoitti vahvimman AD-spesifisyyden, jota seurasivat myelinaatio- ja gliaryhmä. Pienemmässä määrin FTD osoittaa myös kasvua näiden paneelien välillä, mikä saattaa heijastaa samanlaisia mahdollisia verkon muutoksia (17). Sitä vastoin ALS ja PD osoittivat lähes samat myelinaatio-, glia- ja metabolomiprofiilit kuin kontrolliryhmässä. Kaiken kaikkiaan huolimatta eroista näytteen valmistelussa, MS-alustassa ja TMT-kvantifiointimenetelmissä, nämä toistetut analyysit osoittavat, että prioriteettipaneelimarkkereissamme on erittäin johdonmukaisia AD-spesifisiä muutoksia yli 500 ainutlaatuisessa CSF-näytteessä.
AD-hermosolujen rappeuma on laajalti tunnustettu useita vuosia ennen kognitiivisten oireiden ilmaantumista, joten AsymAD:n biomarkkereille on kiireellinen tarve (5, 31). Yhä useammat todisteet kuitenkin osoittavat, että AsymAD:n biologia ei ole kaukana homogeenisesta, ja riskin ja sietokyvyn monimutkainen vuorovaikutus johtaa suuriin yksilöllisiin eroihin sairauden myöhemmässä etenemisessä (47). Vaikka niitä käytetään AsymAD-tapausten tunnistamiseen, CSF:n ydinbiomarkkerien (Aβ1-42, kokonaistau ja p-tau) tasot eivät ole osoittautuneet pystyvän luotettavasti ennustamaan, kuka etenee dementiaan (4, 7), mikä viittaa siihen, että se voi olla On tarpeen sisällyttää kokonaisvaltaiset biomarkkerityökalut, jotka perustuvat useisiin aivojen fysiologian näkökohtiin, jotta tämän populaation riskit voidaan määrittää tarkasti. Siksi analysoimme myöhemmin AD-validoidun biomarkkeripaneelimme CSF-kopion 1 AsymAD-populaatiossa. Nämä 31 AsymAD-tapausta osoittivat epänormaaleja ydinbiomarkkeritasoja (Aβ1–42/koko ELISA-suhde, <5,5) ja täydellistä kognitiota (keskimääräinen MoCA, 27,1). ± 2,2) (taulukko S1A). Lisäksi kaikilla AsymAD-potilailla on kliininen dementiapistemäärä 0, mikä osoittaa, että päivittäisen kognitiivisen tai toiminnallisen suorituskyvyn heikkenemisestä ei ole näyttöä.
Analysoimme ensin validoitujen paneelien tasot kaikissa 96 CSF-kopiossa 1, mukaan lukien AsymAD-kohortti. Havaitsimme, että useissa AsymAD-ryhmän paneeleissa oli merkittäviä AD:n kaltaisia runsausmuutoksia, verisuonipaneeli osoitti AsymAD:n laskevaa trendiä, kun taas kaikki muut paneelit osoittivat nousevaa trendiä (kuva 6A). Siksi kaikki paneelit osoittivat erittäin merkittävää korrelaatiota ELISA Aβ1-42:n ja kokonaistau-tasojen kanssa (kuvio 6B). Sitä vastoin ryhmän ja MoCA-pisteiden välinen korrelaatio on suhteellisen heikko. Yksi näiden analyysien silmiinpistävimmistä havainnoista on AsymAD-kohortin paneelien runsaus. Kuten kuvassa 6A esitetään, AsymAD-ryhmän paneelitaso ylittää yleensä kontrolliryhmän ja AD-ryhmän paneelitason, mikä osoittaa suhteellisen suurta vaihtelua. Tämän AsymAD:n heterogeenisyyden tutkimiseksi edelleen sovelsimme moniulotteisen skaalausanalyysin (MDS) analyysiä 96 CSF:n replikaatio 1 -tapaukseen. MDS-analyysi mahdollistaa tapausten välisen samankaltaisuuden visualisoinnin tietojoukon tiettyjen muuttujien perusteella. Tässä klusterianalyysissä käytämme vain niitä validoituja paneelimarkkereita, joilla on tilastollisesti merkitsevä muutos (P <0,05, AD/kontrolli) CSF:n löydön ja replikaation 1 proteomin (n = 29) (taulukko S2L) tasolla. Tämä analyysi tuotti selkeän spatiaalisen klusteroinnin kontrolli- ja AD-tapausten välille (kuva 6C). Sitä vastoin jotkut AsymAD-tapaukset ovat selkeästi ryhmittyneet kontrolliryhmään, kun taas toiset sijaitsevat AD-tapauksissa. Tämän AsymAD-heterogeenisyyden tutkimiseksi edelleen käytimme MDS-karttaamme määrittämään kaksi ryhmää näistä AsymAD-tapauksista. Ensimmäiseen ryhmään kuuluivat lähempänä kontrollia ryhmittyneet AsymAD-tapaukset (n = 19), kun taas toiselle ryhmälle oli tunnusomaista AsymAD-tapaukset, joiden markkeriprofiili oli lähempänä AD:ta (n = 12).
(A) CSF-biomarkkeriryhmän ilmentymistaso (z-pisteet) kaikissa 96 näytteessä CSF:n replikaatio 1 -kohortissa, mukaan lukien AsymAD. Varianssianalyysiä Tukeyn jälkikorjauksella käytettiin arvioimaan paneelien runsauden muutosten tilastollista merkitsevyyttä. (B) Paneeliproteiinin runsaustason (z-pistemäärä) korrelaatioanalyysi MoCA-pisteiden ja kokonaistau-tason kanssa ELISA Aβ1-42- ja CSF-kopion 1 näytteissä. Pearson-korrelaatiokerroin vastaavan P-arvon kanssa näytetään. (C) 96 CSF:n kopio 1 -tapauksen MDS perustui 29 validoidun paneelimarkkerin runsaustasoihin, jotka muuttuivat merkittävästi sekä löydös- että CSF-kopio 1 -tietosarjoissa [P <0,05 AD/kontrolli (CT)]. Tätä analyysiä käytettiin jakamaan AsymAD-ryhmä kontrolli- (n = 19) ja AD (n = 12) alaryhmiin. (D) Tulivuorikaavio näyttää kaikkien CSF:n replikaation 1 proteiinien differentiaalisen ilmentymisen log2-kertaisella muutoksella (x-akseli) suhteessa -log10 tilastolliseen P-arvoon kahden AsymAD-alaryhmän välillä. Paneelin biomarkkerit ovat värillisiä. (E) Valintaryhmän biomarkkerien CSF:n replikaation 1 runsaustaso ekspressoituu eri tavalla AsymAD-alaryhmien välillä. Tilastollisen merkitsevyyden arvioimiseen käytettiin Tukeyn jälkisovitettua varianssianalyysiä.
Tutkimme erilaista proteiiniekspressiota näiden kontrolli- ja AD-kaltaisten AsymAD-tapausten välillä (kuvio 6D ja taulukko S2L). Tuloksena oleva tulivuorikartta osoittaa, että 14 paneelimerkkiä on muuttunut merkittävästi näiden kahden ryhmän välillä. Useimmat näistä markkereista ovat synapsin ja metabolomin jäseniä. Kuitenkin SOD1 ja myristoyloitu alaniinirikas proteiinikinaasi C -substraatti (MARCKS), jotka ovat myeliini- ja vastaavasti glia-immuuniryhmien jäseniä, kuuluvat myös tähän ryhmään (kuvio 6, D ja E). Verisuonipaneelissa oli myös kaksi markkeria, jotka vähenivät merkittävästi AD:n kaltaisessa AsymAD-ryhmässä, mukaan lukien AE:tä sitova proteiini 1 (AEBP1) ja komplementtiperheen jäsen C9. Kontrollin ja AD:n kaltaisten AsymAD-alaryhmien välillä ei ollut merkitsevää eroa ELISA AB1-42:ssa (P = 0,38) ja p-tau:ssa (P = 0,28), mutta kokonaistau-tasossa oli todella merkittävä ero (P = 0,0031). ) (Kuva S7). On olemassa useita paneelimarkkereita, jotka osoittavat, että muutokset kahden AsymAD-alaryhmän välillä ovat merkittävämpiä kuin kokonaistau-tasot (esimerkiksi YWHAZ, SOD1 ja MDH1) (kuvio 6E). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että validoitu paneelimme voi sisältää biomarkkereita, jotka voivat ryhmitellä oireettoman sairauden potilaiden ja niiden riskin.
Tarvitaan kiireesti järjestelmäpohjaisia biomarkkerityökaluja, joilla voidaan mitata ja kohdentaa paremmin AD:n taustalla olevia erilaisia patofysiologioita. Näiden työkalujen odotetaan paitsi muuttavan AD-diagnostiikkaamme, myös edistävän tehokkaiden, potilaskohtaisten hoitostrategioiden käyttöönottoa (1, 2). Tätä tarkoitusta varten sovelsimme puolueetonta kattavaa proteomiikan lähestymistapaa AD-aivoihin ja CSF:ään tunnistaaksemme verkkopohjaisia CSF-biomarkkereita, jotka heijastavat laajaa aivopohjaista patofysiologiaa. Analyysimme tuotti viisi CSF-biomarkkeripaneelia, jotka (i) heijastavat synapseja, verisuonia, myeliiniä, immuuni- ja aineenvaihduntahäiriöitä; (ii) osoitettava vahva toistettavuus eri MS-alustoilla; (iii) Näytä progressiiviset sairauskohtaiset muutokset AD:n varhaisessa ja myöhäisessä vaiheessa. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot edustavat lupaavaa askelta kohti monipuolisten, luotettavien, verkkopohjaisten biomarkkerityökalujen kehittämistä AD-tutkimukseen ja kliinisiin sovelluksiin.
Tuloksemme osoittavat AD-aivoverkoston proteomin erittäin konservoituneen organisaation ja tukevat sen käyttöä ankkurina järjestelmäpohjaiseen biomarkkerien kehittämiseen. Analyysimme osoittaa, että kahdella itsenäisellä TMT-MS-tietojoukolla, jotka sisältävät AD- ja AsymAD-aivot, on vahva modulaarisuus. Nämä havainnot laajentavat aikaisempaa työtämme osoittaen, että yli 2 000 aivokudoksen tehokkaat moduulit ovat säilyneet useista riippumattomista kohortteista etu-, parietaali- ja temporaalisessa aivokuoressa (17). Tämä konsensusverkosto heijastaa erilaisia sairauksiin liittyviä muutoksia, joita on havaittu nykyisessä tutkimuksessa, mukaan lukien gliarikkaiden tulehdusmoduulien lisääntyminen ja hermosolurikkaiden moduulien väheneminen. Kuten nykyinen tutkimus, tämä laajamittainen verkosto sisältää myös merkittäviä modulaarisia muutoksia AsymAD: ssä, mikä osoittaa erilaisia prekliinisiä patofysiologioita (17).
Tässä erittäin konservatiivisessa järjestelmäpohjaisessa kehyksessä on kuitenkin hienojakoisempaa biologista heterogeenisyyttä erityisesti AD:n alkuvaiheessa olevien yksilöiden keskuudessa. Biomarkkeripaneelimme pystyy kuvaamaan kahta AsymAD:n alaryhmää, jotka osoittavat useiden CSF-markkerien merkittävän erilaisen ilmentymisen. Ryhmämme pystyi tuomaan esiin näiden kahden alaryhmän väliset biologiset erot, jotka eivät olleet ilmeisiä AD-biomarkkerien tasolla. Verrattuna kontrolliryhmään näiden AsymAD-yksilöiden Aβ1-42/ta-kokonaissuhteet olivat epänormaalin alhaiset. Kuitenkin vain kokonaistau-tasot erosivat merkittävästi kahden AsymAD-alaryhmän välillä, kun taas Aβ1-42- ja p-tau-tasot pysyivät suhteellisen vertailukelpoisina. Koska korkea CSF-tau näyttää olevan parempi kognitiivisten oireiden ennustaja kuin Aβ1-42-tasot (7), epäilemme, että kahdella AsymAD-kohortilla voi olla erilaiset taudin etenemisen riskit. Ottaen huomioon AsymAD:n rajallisen otoskoon ja pitkittäistietojen puutteen, tarvitaan lisätutkimuksia näiden johtopäätösten tekemiseksi. Nämä tulokset osoittavat kuitenkin, että järjestelmäpohjainen CSF-paneeli voi parantaa kykyämme ryhmitellä yksilöitä tehokkaasti taudin oireettoman vaiheen aikana.
Kaiken kaikkiaan havainnot tukevat useiden biologisten toimintojen roolia AD:n patogeneesissä. Säätelemättömästä energia-aineenvaihdunnasta tuli kuitenkin kaikkien viiden validoidun merkintäpaneelimme näkyvä teema. Metaboliset proteiinit, kuten hypoksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasi 1 (HPRT1) ja laktaattidehydrogenaasi A (LDHA), ovat vahvimmin validoituja synaptisia biomarkkereita, mikä osoittaa, että AD CSF:n lisääntyminen on erittäin toistettavaa sukupuolta. Verisuonissamme ja gliapaneelissamme on myös useita markkereita, jotka osallistuvat oksidatiivisten aineiden aineenvaihduntaan. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia sen keskeisen roolin kanssa, joka aineenvaihduntaprosesseilla on koko aivoissa, ei vain hermosolujen suuren energiantarpeen tyydyttämisessä, vaan myös astrosyyttien ja muiden gliasolujen suuren energiantarpeen tyydyttämisessä (17, 48). Tuloksemme tukevat kasvavaa näyttöä siitä, että muutokset redox-potentiaalissa ja energiapolkujen katkeaminen voivat olla keskeinen yhteys useiden AD:n patogeneesiin liittyvien avainprosessien välillä, mukaan lukien mitokondriohäiriöt, gliavälitteinen tulehdus ja verisuonivaurio (49). Lisäksi metaboliset aivo-selkäydinnesteen biomarkkerit sisältävät suuren määrän erilaisia rikkaita proteiineja kontrolli- ja AD:n kaltaisten AsymAD-alaryhmiemme välillä, mikä viittaa siihen, että näiden energia- ja redox-reittien katkeaminen voi olla kriittistä taudin prekliinisessä vaiheessa.
Havaimillamme erilaisilla aivo- ja selkäydinnestepaneelitrendeillä on myös mielenkiintoisia biologisia vaikutuksia. Neuroneja sisältävät synapsit ja metabolomit osoittavat alentuneita tasoja AD-aivoissa ja lisääntyneen aivo-selkäydinnesteen määrässä. Ottaen huomioon, että hermosoluissa on runsaasti energiaa tuottavia mitokondrioita synapseissa tarjotakseen energiaa lukuisille erikoistuneille signaaleilleen (50), näiden kahden hermosoluryhmän ilmentymisprofiilien samankaltaisuus on odotettavissa. Hermosolujen häviäminen ja vaurioituneiden solujen pursotus voivat selittää nämä aivo- ja CSF-paneelitrendit myöhemmissä sairauksissa, mutta ne eivät voi selittää havaitsemiamme varhaisia paneelin muutoksia (13). Yksi mahdollinen selitys näille varhaisen oireettoman taudin löydöksille on epänormaali synaptinen karsiminen. Uudet todisteet hiirimalleissa viittaavat siihen, että mikrogliavälitteinen synaptinen fagosytoosi voi aktivoitua epänormaalisti AD:ssa ja johtaa varhaiseen synapsien katoamiseen aivoissa (51). Tämä hylätty synaptinen materiaali voi kertyä CSF:ään, minkä vuoksi havaitsemme CSF:n lisääntymisen hermosolupaneelissa. Immuunivälitteinen synaptinen karsiminen voi myös osittain selittää gliaproteiinien lisääntymisen, jota havaitsemme aivoissa ja aivo-selkäydinnesteessä koko sairausprosessin ajan. Synaptisen karsimisen lisäksi eksosyyttisen reitin yleiset poikkeavuudet voivat myös johtaa hermosolujen markkerien erilaisiin aivo- ja CSF-ilmentymiin. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että eksosomien sisältö AD-aivojen patogeneesissä on muuttunut (52). Solunulkoinen reitti on myös osallisena Ap:n proliferaatiossa (53, 54). On syytä huomata, että eksosomaalisen erityksen suppressio voi vähentää AD:n kaltaista patologiaa AD-siirtogeenisissä hiirimalleissa (55).
Samanaikaisesti verisuonipaneelin proteiini osoitti kohtalaista kasvua AD-aivoissa, mutta väheni merkittävästi CSF:ssä. Veri-aivoesteen (BBB) toimintahäiriö voi osittain selittää nämä havainnot. Monet riippumattomat kuolemanjälkeiset ihmistutkimukset ovat osoittaneet BBB:n hajoamisen AD:ssa (56, 57). Nämä tutkimukset vahvistivat erilaisia epänormaaleja aktiviteetteja, jotka ympäröivät tätä tiiviisti suljettua endoteelisolukerrosta, mukaan lukien aivojen kapillaarivuoto ja veren kautta kulkevien proteiinien perivaskulaarinen kertyminen (57). Tämä voi tarjota yksinkertaisen selityksen kohonneille verisuoniproteiineille aivoissa, mutta se ei voi täysin selittää näiden samojen proteiinien ehtymistä aivo-selkäydinnesteestä. Yksi mahdollisuus on, että keskushermosto eristää aktiivisesti näitä molekyylejä ratkaistakseen lisääntyneen tulehduksen ja oksidatiivisen stressin ongelman. Joidenkin vakavimpien CSF-proteiinien väheneminen tässä paneelissa, erityisesti niiden, jotka osallistuvat lipoproteiinisäätelyyn, liittyy haitallisten tulehdustasojen ja reaktiivisten happilajien hermoja suojaavan prosessin estämiseen. Tämä pätee paroksonaasi 1:een (PON1), lipoproteiineja sitovalle entsyymille, joka on vastuussa verenkierron oksidatiivisen stressin vähentämisestä (58, 59). Alfa-1-mikroglobuliini/bikuniiniprekursori (AMBP) on toinen verisuoniryhmän merkittävästi heikentynyt markkeri. Se on lipidinkuljettajan bikuniinin esiaste, joka myös osallistuu tulehduksen hillitsemiseen ja neurologiseen suojaukseen (60, 61).
Useista mielenkiintoisista hypoteeseista huolimatta kyvyttömyys havaita suoraan biokemiallisia sairausmekanismeja on tunnettu rajoitus löytövetoiselle proteomiikan analyysille. Siksi lisätutkimusta tarvitaan näiden biomarkkeripaneelien taustalla olevien mekanismien määrittämiseksi. MS-pohjaisen kliinisen analyysin kehittämiseen siirtyminen edellyttää myös kohdennettujen kvantitatiivisten menetelmien käyttöä laajamittaisessa biomarkkeriverifioinnissa, kuten selektiivinen tai rinnakkaisreaktioseuranta (62). Käytimme äskettäin rinnakkaista reaktioseurantaa (63) monien tässä kuvattujen CSF-proteiinimuutosten validoimiseksi. Useat ensisijaiset paneelikohteet on kvantifioitu merkittävällä tarkkuudella, mukaan lukien YWHAZ, ALDOA ja SMOC1, jotka vastaavat synapsi-, aineenvaihdunta- ja tulehduspaneelejamme (63). Independent Data Acquisition (DIA) ja muut MS-pohjaiset strategiat voivat myös olla hyödyllisiä kohteen varmentamisessa. Bud et ai. (64) Äskettäin osoitettiin, että CSF-hakutietojoukossamme tunnistettujen AD-biomarkkereiden ja riippumattoman DIA-MS-tietojoukon välillä, joka koostuu lähes 200 CSF-näytteestä kolmesta eri eurooppalaisesta kohortista, on merkittävä päällekkäisyys. Nämä viimeaikaiset tutkimukset tukevat paneeliemme mahdollisuuksia muuttua luotettavaksi MS-pohjaiseksi havaitsemiseksi. Perinteinen vasta-aine- ja aptameeripohjainen havaitseminen on myös tärkeää keskeisten AD-biomarkkerien jatkokehityksen kannalta. CSF:n vähäisestä määrästä johtuen näitä biomarkkereita on vaikeampi havaita korkean suorituskyvyn MS-menetelmillä. NEFL ja NRGN ovat kaksi esimerkkiä vähän esiintyvistä CSF-biomarkkereista, jotka on kartoitettu paneeliin kattavassa analyysissämme, mutta joita ei voida havaita luotettavasti käyttämällä yhtä MS-strategiaamme. Useisiin vasta-aineisiin, kuten PEA:han, perustuvat kohdistusstrategiat voivat edistää näiden markkerien kliinistä transformaatiota.
Kaiken kaikkiaan tämä tutkimus tarjoaa ainutlaatuisen proteomiikan lähestymistavan CSF AD -biomarkkerien tunnistamiseen ja todentamiseen erilaisiin järjestelmiin perustuen. Näiden merkkipaneelien optimointi ylimääräisten AD-kohorttien ja MS-alustojen kesken voi osoittautua lupaavalta edistää AD-riskin kerrostumista ja hoitoa. Tutkimukset, jotka arvioivat näiden paneelien pitkittäistasoa ajan myötä, ovat myös kriittisiä määritettäessä, mikä merkkiaineiden yhdistelmä kerrostaa parhaiten varhaisen sairauden riskin ja taudin vaikeusasteen muutokset.
Lukuun ottamatta kolmea CSF:n kopioimaa näytettä, kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt CSF-näytteet kerättiin Emory ADRC:n tai läheisesti liittyvien tutkimuslaitosten suojeluksessa. Näissä proteomiikkatutkimuksissa käytettiin yhteensä neljä sarjaa Emory CSF -näytteitä. CSF-kohortin havaittiin sisältävän näytteitä 20 terveeltä kontrollilta ja 20 AD-potilaalta. CSF-kopio 1 sisältää näytteet 32 terveestä kontrollista, 31 AsymAD-henkilöstä ja 33 AD-henkilöstä. CSF-kopio 2 sisältää 147 kontrollia ja 150 AD-näytettä. Monen sairauden CSF-replikaation 4 kohortti sisälsi 18 kontrollia, 17 AD-, 19 ALS-, 13 PD- ja 11 FTD-näytettä. Emory University Institutional Review Boardin hyväksymän sopimuksen mukaan kaikki Emory-tutkimukseen osallistuneet saivat tietoisen suostumuksen. Vuoden 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimer's Centers -ohjeiden (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) mukaan aivo-selkäydinneste kerättiin ja varastoitiin lannepunktiolla. Kontrolli- ja AsymAD- ja AD-potilaat saivat standardoidun kognitiivisen arvioinnin Emory Cognitive Neurology Clinicissä tai Goizuetan ADRC:ssä. Heidän aivo-selkäydinnestenäytteet testattiin INNO-BIA AlzBio3 Luminexilla ELISA Aβ1-42:n, kokonais-tau- ja p-tau-analyysin (65 ui) suhteen. ELISA-arvoja käytetään tukemaan koehenkilöiden diagnostista luokittelua vakiintuneiden AD-biomarkkerin rajakriteerien perusteella (66, 67). Myös muiden CSF-diagnoosien (FTD, ALS ja PD) demografiset ja diagnostiset perustiedot saadaan Emory ADRC:ltä tai siihen liittyvistä tutkimuslaitoksista. Näiden Emory CSF -tapausten yhteenvetotapausten metatiedot löytyvät taulukosta S1A. Sveitsin CSF:n replikaation 3 kohortin ominaisuudet on julkaistu aiemmin (45).
CSF löysi näytteen. CSF-tietojoukon löydön syvyyden lisäämiseksi suoritettiin runsaasti runsaasti proteiineja sisältävien proteiinien kulutus ennen trypsinointia. Lyhyesti sanottuna 130 μl CSF:ää 40 yksittäisestä CSF-näytteestä ja yhtä suuri tilavuus (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resiniä (Thermo Fisher Scientific, A36372) laitettiin spinkolonniin (Thermo Fisher Scientific, A89868) huoneeseen. lämpötila Inkuboi). Kun näytettä on pyöritetty 15 minuuttia, sentrifugoi näytettä 1000 g:ssä 2 minuuttia. 3K ultrasentrifugisuodatinlaitetta (Millipore, UFC500396) käytettiin poistovesinäytteen väkevöimiseen sentrifugoimalla 14 000 g 30 minuuttia. Laimenna kaikki näytemäärät 75 μl:ksi fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella. Proteiinipitoisuus arvioitiin bikinkoniinihappo (BCA) -menetelmällä valmistajan protokollan mukaisesti (Thermo Fisher Scientific). Kaikista 40 näytteestä peräisin oleva immuunipuutteinen CSF (60 μl) digestoitiin lysyyliendopeptidaasilla (LysC) ja trypsiinillä. Lyhyesti sanottuna näyte pelkistettiin ja alkyloitiin 1,2 μl:lla 0,5 M tris-2(-karboksietyyli)-fosfiinia ja 3 μl:lla 0,8 M klooriasetamidia 90 °C:ssa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen sitä sonikoitiin vesihauteessa 15 minuuttia. Näyte laimennettiin 193 μl:lla 8 M ureapuskuria [8 M urea ja 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] lopulliseen 6 M ureapitoisuuteen. LysC:tä (4,5 μg; Wako) käytetään yön yli tapahtuvaan digestioon huoneenlämpötilassa. Näyte laimennettiin sitten 1 M ureaan 50 mM ammoniumbikarbonaatilla (ABC) (68). Lisää yhtä suuri määrä (4,5 μg) trypsiiniä (Promega) ja inkuboi näytettä 12 tuntia. Tee pilkottu peptidiliuos happamaksi 1 % muurahaishappoa (FA) ja 0,1 % trifluorietikkahappoa (TFA) (66) olevaan lopulliseen pitoisuuteen (66) ja poista sitten suola 50 mg:n Sep-Pak C18 -pylväällä (Waters) edellä kuvatulla tavalla (25). . Peptidi eluoitiin sitten 1 ml:ssa 50 % asetonitriiliä (ACN). Proteiinien kvantifioinnin standardoimiseksi erien (25) välillä yhdistettiin 100 µl:n alikvootit kaikista 40 CSF-näytteestä sekanäyteeksi, joka jaettiin sitten viiteen maailmanlaajuisen sisäisen standardin (GIS) näytteeseen (48). Kaikki yksittäiset näytteet ja yhdistetyt standardit kuivataan nopealla tyhjiöllä (Labconco).
CSF kopioi näytteen. Dayon ja kollegat ovat aiemmin kuvanneet immuunijärjestelmän heikkenemistä ja CSF-kopion 3 näytteiden pilkkomista (45, 46). Jäljelle jääneet rinnakkaisnäytteet eivät olleet yksittäin immuunipuutteisia. Pilko nämä poistamattomat näytteet trypsiinissä aiemmin kuvatulla tavalla (17). Jokaista toistettua analyysiä varten 120 µl:n erät eluoitunutta peptidiä kustakin näytteestä yhdistettiin ja jaettiin yhtä suuriin eriin käytettäväksi TMT-merkittynä globaalina sisäisenä standardina (48). Kaikki yksittäiset näytteet ja yhdistetyt standardit kuivataan nopealla tyhjiöllä (Labconco). Vähäisen CSF-proteiinin signaalin tehostamiseksi yhdistämällä 125 μl kustakin näytteestä valmistettiin "tehostettu" näyte jokaista rinnakkaisanalyysiä varten [eli biologinen näyte, joka jäljittelee tutkimusnäytettä, mutta käytettävissä oleva määrä on paljon suurempi (37, 69)] yhdistettiin seka-CSF-näytteeksi (17). Sekoitettu näyte immunopoistettiin sitten käyttämällä 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin -hartsia (Thermo Fisher Scientific, A36372), digestoitiin edellä kuvatulla tavalla ja sisällytettiin myöhempään moninkertaiseen TMT-leimaukseen.
Postitusaika: 27.8.2021