Kiitos vierailustasi Nature.comissa. Käyttämässäsi selainversiossa on rajoitettu CSS-tuki. Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa). Sillä välin varmistaaksemme jatkuvan tuen hahmonnamme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Termofiilit ovat mikro-organismeja, jotka viihtyvät korkeissa lämpötiloissa. Niiden tutkiminen voi antaa arvokasta tietoa elämän sopeutumisesta ääriolosuhteisiin. Perinteisillä optisilla mikroskoopeilla on kuitenkin vaikea saavuttaa korkeita lämpötiloja. Paikalliseen resistiiviseen sähkölämmitykseen perustuvia kotitekoisia ratkaisuja on ehdotettu useita, mutta yksinkertaista kaupallista ratkaisua ei ole. Tässä artikkelissa esittelemme mikroskaalan laserlämmityksen käsitteen mikroskoopin näkökentän yli korkean lämpötilan aikaansaamiseksi termofiilisille tutkimuksille pitäen samalla käyttäjän ympäristön lievänä. Mikromittakaavakuumennus kohtuullisella laserintensiteetillä voidaan saavuttaa käyttämällä kulta-nanohiukkaspäällysteistä substraattia bioyhteensopivana ja tehokkaana valon absorboijana. Tarkastellaan mikromittakaavan nesteen konvektion, solujen retention ja keskipakoistermoforeettisen liikkeen mahdollisia vaikutuksia. Menetelmä on osoitettu kahdella lajilla: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktiivinen termofiilinen bakteeri, joka lisääntyy noin 65 °C:ssa ja jonka olemme havainneet itävän, kasvavan ja uivan mikromittakaavan lämmityksessä; (ii) Thiobacillus sp., optimaalisesti hypertermofiilinen arkea. 80°C:ssa. Tämä työ tasoittaa tietä termofiilisten mikro-organismien yksinkertaiselle ja turvalliselle havainnolle nykyaikaisilla ja edullisilla mikroskopiatyökaluilla.
Miljardien vuosien aikana elämä maapallolla on kehittynyt sopeutumaan monenlaisiin ympäristöolosuhteisiin, joita joskus pidetään äärimmäisinä ihmisen näkökulmasta. Erityisesti jotkin termofiiliset mikro-organismit (bakteerit, arkeat, sienet), joita kutsutaan termofiileiksi, viihtyvät lämpötila-alueella 45 °C - 122 °C1, 2, 3, 4. Termofiilit elävät erilaisissa ekosysteemeissä, kuten syvänmeren hydrotermisissä aukoissa, kuumissa lähteissä. tai vulkaanisia alueita. Heidän tutkimuksensa on herättänyt paljon kiinnostusta viime vuosikymmeninä ainakin kahdesta syystä. Ensinnäkin voimme oppia heiltä esimerkiksi kuinka termofiilit 5, 6, entsyymit 7, 8 ja kalvot 9 ovat stabiileja näin korkeissa lämpötiloissa tai kuinka termofiilit kestävät äärimmäisiä säteilytasoja10. Toiseksi ne ovat perusta monille tärkeille bioteknologisille sovelluksille1, 11, 12, kuten polttoaineen tuotanto13, 14, 15, 16, kemiallinen synteesi (dihydro, alkoholit, metaani, aminohapot jne.)17, biolouhinta18 ja lämpöstabiilit biokatalyytit7 ,11, 13. Erityisesti tällä hetkellä hyvin tunnettu polymeraasiketjureaktio (PCR)19 sisältää entsyymin (Taq-polymeraasi), joka on eristetty termofiilisestä Thermus aquaticus -bakteerista, joka on yksi ensimmäisistä löydetyistä termofiileistä.
Termofiilien tutkiminen ei kuitenkaan ole helppo tehtävä, eikä sitä voida improvisoida missään biologisessa laboratoriossa. Erityisesti eläviä termofiilejä ei voida havaita in vitro millään standardilla valomikroskoopilla, edes kaupallisesti saatavilla olevilla lämmityskammioilla, jotka on yleensä mitoitettu niinkin alhaisiin lämpötiloihin kuin 40 °C. 1990-luvulta lähtien vain harvat tutkimusryhmät ovat omistautuneet korkean lämpötilan mikroskopiajärjestelmien (HTM) käyttöönotolle. Vuonna 1994 Glukh et ai. Lämmitys/jäähdytyskammio suunniteltiin perustuen Peltier-kennon käyttöön, joka säätelee suorakaiteen muotoisten kapillaarien lämpötilaa suljettujen anaerobisuuden ylläpitämiseksi 20 . Laite voidaan lämmittää 100 °C:seen nopeudella 2 °C/s, jolloin kirjoittajat voivat tutkia hypertermofiilisen bakteerin Thermotoga maritima21 liikkuvuutta. Vuonna 1999 Horn et ai. Hyvin samanlainen laite on kehitetty, joka perustuu edelleen kaupalliseen mikroskopiaan soveltuvien lämmitettyjen kapillaarien käyttöön solujen jakautumisen/yhteyden tutkimiseksi. Pitkän suhteellisen epäaktiivisuuden jälkeen tehokkaiden HTM:ien etsintä jatkui vuonna 2012, erityisesti Wirth-ryhmän julkaisusarjan yhteydessä, jossa käytettiin Hornin et al. Viisitoista vuotta sitten useiden arkkien, mukaan lukien hypertermofiilien, liikkuvuutta tutkittiin 100 °C:n lämpötiloissa lämmitetyillä kapillaareilla23,24. He myös muuttivat alkuperäistä mikroskooppia nopeamman kuumenemisen saavuttamiseksi (useita minuutteja 35 minuutin sijaan asetetun lämpötilan saavuttamiseksi) ja yli 2 cm:n lineaarisen lämpötilagradientin saavuttamiseksi väliaineen poikki. Tätä lämpötilagradientin muotoilulaitetta (TGFD) on käytetty monien termofiilien liikkuvuuden tutkimiseen lämpötilagradienteissa biologisesti merkityksellisillä etäisyyksillä 24, 25 .
Suljettujen kapillaarien lämmittäminen ei ole ainoa tapa tarkkailla eläviä termofiilejä. Vuonna 2012 Kuwabara et al. Käytettiin kotitekoisia kertakäyttöisiä Pyrex-kammioita, jotka oli suljettu lämmönkestävällä liimalla (Super X2; Cemedine, Japani). Näytteet asetettiin kaupallisesti saataville läpinäkyvälle kuumennuslevylle (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japani), joka kykeni kuumentamaan 110 °C:seen, mutta jota ei alun perin tarkoitettu biokuvaukseen. Kirjoittajat havaitsivat anaerobisten termofiilisten bakteerien (Thermosipho globiformans, kaksinkertaistumisaika 24 min) tehokkaan jakautumisen 65 °C:ssa. Vuonna 2020 Pulshen et al. Kaupallisten metalliastioiden (AttofluorTM, Thermofisher) tehokas kuumennus demonstroitiin käyttämällä kahta kotitekoista lämmityselementtiä: kantta ja lavaa (PCR-konevaikutteinen konfiguraatio). Tämä yhdistäminen johtaa tasaiseen nesteen lämpötilaan ja estää haihtumisen ja kondensoitumisen kannen alaosassa. O-renkaan käyttö välttää kaasunvaihdon ympäristön kanssa. Tätä HTM:ää, nimeltään Sulfoscope, käytettiin kuvaamaan Sulfolobus acidocaldarius 75°C27 lämpötilassa.
Kaikkien näiden järjestelmien tunnustettu rajoitus oli rajoitus ilmaobjektiivien käyttöön, mikä tahansa öljyimmersio ei sovellu niin korkeaan lämpötilaan ja kuvantamiseen yli 1 mm:n paksuisten läpinäkyvien näytteiden läpi. Kaikkien näiden järjestelmien tunnustettu rajoitus oli rajoitus ilmaobjektiivien käyttöön, mikä tahansa öljyimmersio ei sovellu niin korkeaan lämpötilaan ja kuvantamiseen yli 1 mm:n paksuisten läpinäkyvien näytteiden läpi. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективсков, объективоль, погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачны через прозрачны Kaikkien näiden järjestelmien tunnustettu puute oli ilmaobjektiivien käytön rajoitus, koska mikään öljyupotus ei soveltunut niin korkeaan lämpötilaan eikä visualisointiin läpinäkyvien > 1 mm paksujen näytteiden läpi.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适叹浸都不适吂嚿毫米厚的透明样品成像. Kaikkien näiden järjestelmien tunnustettu rajoitus on ilmapeilin käytön rajoitus, koska mikään öljyupotus ei sovellu yli 1 mm paksuisten läpinäkyvien näytteiden kuvaamiseen näin korkeissa lämpötiloissa. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушорных обюмовектиморных ужение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозмрачные образцы нол1щицы нол1щих температур и визуализации через прозмрачные образцы Kaikkien näiden järjestelmien tunnustettu haittapuoli on ilmalinssien rajallinen käyttö, mikään öljyupotus ei sovellu niin korkeille lämpötiloille ja visualisointi läpinäkyvien > 1 mm paksujen näytteiden läpi.Myöhemmin tämän rajoituksen poistivat Charles-Orzag et ai. 28, joka kehitti laitteen, joka ei enää tuota lämpöä kiinnostavan järjestelmän ympärille, vaan itse suojalasin sisäpuolelle, joka on peitetty ohuella läpinäkyvällä ITO:sta (indium-tinaoksidi) valmistetulla vastuskerroksella. Kansi voidaan lämmittää 75 °C:een johtamalla sähkövirta läpinäkyvän kerroksen läpi. Tekijän on kuitenkin myös lämmitettävä linssi objektiiviin, mutta enintään 65 °C, jotta se ei vahingoitu.
Nämä työt osoittavat, että tehokkaan korkean lämpötilan optisen mikroskopian kehittämistä ei ole otettu laajalti käyttöön, se vaatii usein kotitekoisia laitteita ja se saavutetaan usein spatiaalisen erottelukyvyn kustannuksella, mikä on vakava haitta, koska termofiilisiä mikro-organismeja on vain muutama. mikrometriä. Pienempi lämmitystilavuus on avain kolmen HTM:n ongelman ratkaisemiseen: huono tilaresoluutio, suuri lämpöinertia järjestelmän lämmetessä ja ympäröivien elementtien (immersioöljy, objektiivi… tai käyttäjän kädet) haitallinen kuumeneminen äärimmäisissä lämpötiloissa. ).
Tässä artikkelissa esittelemme termofiilisen havainnoinnin HTM:n, joka ei perustu resistiiviseen lämmitykseen. Sen sijaan saavutimme paikallisen kuumennuksen mikroskoopin näkökentän rajoitetulla alueella valoa absorboivan substraatin lasersäteilytyksellä. Lämpötilajakauma visualisoitiin käyttämällä kvantitatiivista faasimikroskopiaa (QPM). Tämän menetelmän tehokkuutta osoittavat Geobacillus stearothermophilus, liikkuva termofiilinen bakteeri, joka lisääntyy noin 65 °C:ssa ja jolla on lyhyt kaksinkertaistumisaika (noin 20 minuuttia), ja Sulfolobus shibatae, hypertermofiili, joka kasvaa optimaalisesti 80 °C:ssa (archaea). havainnollistamaan. Normaali replikaationopeus ja uinti havaittiin lämpötilan funktiona. Tätä laser HTM:ää (LA-HTM) ei rajoita peitinlasien paksuus tai objektiivin luonne (ilma- tai öljyimmersio). Tämä mahdollistaa kaikkien markkinoilla olevien korkearesoluutioisten objektiivien käytön. Se ei myöskään kärsi hitaasta kuumenemisesta lämpöinertian vuoksi (saavuttaa välittömän kuumennuksen millisekunnin mittakaavassa) ja käyttää vain kaupallisesti saatavia komponentteja. Ainoat uudet turvallisuusongelmat liittyvät voimakkaiden lasersäteiden (tyypillisesti jopa 100 mW) läsnäoloon laitteen sisällä ja mahdollisesti silmien läpi, mikä vaatii suojalaseja.
LA-HTM:n periaate on lämmittää näyte paikallisesti mikroskoopin näkökentässä laserilla (kuva 1a). Tätä varten näytteen on oltava valoa absorboiva. Kohtuullisen lasertehon (alle 100 mW) käyttämiseksi emme luottaneet nestemäisen väliaineen valon absorptioon, vaan lisäsimme keinotekoisesti näytteen absorptiota päällystämällä alustan kullan nanohiukkasilla (kuva 1c). Kullan nanohiukkasten lämmittäminen valolla on olennaisen tärkeää lämpöplasmoniikan alalla, ja sitä voidaan käyttää biolääketieteessä, nanokemiassa tai auringonvalon keräämisessä29, 30, 31. Viime vuosien aikana olemme käyttäneet tätä LA-HTM:ää useissa tutkimuksissa, jotka liittyvät lämpöplasmasovelluksiin fysiikan, kemian ja biologian alalla. Tämän menetelmän suurin vaikeus on lopullisen lämpötilaprofiilin näyttäminen, koska kohonnut lämpötila on rajoitettu mikromittakaavan alueelle näytteen sisällä. Olemme osoittaneet, että lämpötilakartoitus voidaan saavuttaa neljän aallonpituuden poikittaisleikkausinterferometrillä, joka on yksinkertainen, korkearesoluutioinen ja erittäin herkkä kvantitatiivisen faasimikroskopian menetelmä, joka perustuu kaksiulotteisten diffraktiohilojen (tunnetaan myös nimellä ristikkäiset hilat) käyttöön. 33,34,35,36. Tämän ristikkäiseen hila-aaltorintamikroskooppiin (CGM) perustuvan lämpömikroskopiatekniikan luotettavuus on osoitettu kymmenissä julkaisuissa, jotka on julkaistu viimeisen vuosikymmenen aikana37,38,39,40,41,42,43.
Rinnakkaisen laserlämmitys-, muotoilu- ja lämpötilamikroskoopin asennuskaavio. b Näytegeometria, joka koostuu AttofluorTM-kammiosta, joka sisältää kultananohiukkasilla päällystetyn peitinlasin. c Katso näytettä tarkasti (ei mittakaavassa). d edustaa tasaista lasersäteen profiilia ja (e) simuloitua seuraavaa lämpötilajakaumaa kultananohiukkasten näytetasolla. f on rengasmainen lasersädeprofiili, joka soveltuu tasaisen lämpötilan tuottamiseen, kuten on esitetty kohdassa (g) esitetyssä tuloksena olevan lämpötilajakauman simulaatiossa. Mittakaava: 30 µm.
Erityisesti saavutimme äskettäin nisäkässolujen kuumentamisen LA-HTM:llä ja CGM:llä ja seurasimme solujen lämpösokkivasteita alueella 37-42 °C, mikä osoittaa tämän tekniikan soveltuvuuden yksittäisten elävien solujen kuvantamiseen. LA-HTM:n soveltaminen mikro-organismien tutkimukseen korkeissa lämpötiloissa ei kuitenkaan ole yksiselitteinen, sillä se vaatii enemmän varovaisuutta nisäkässoluihin verrattuna: ensinnäkin alustan pohjan kuumentaminen kymmenillä astetta (ei muutaman asteen) johtaa voimakkaaseen pystysuoraan lämpötilagradienttiin. voi luoda nesteen konvektiota 44, joka voi aiheuttaa ei-toivottua liikettä ja bakteerien sekoittumista, jos se ei ole kiinteästi kiinnitetty alustaan. Tämä konvektio voidaan eliminoida vähentämällä nestekerroksen paksuutta. Tätä tarkoitusta varten kaikissa alla esitetyissä kokeissa bakteerisuspensiot asetettiin kahden noin 15 um paksun peitinlasin väliin, jotka oli sijoitettu metallikupin sisään (AttofluorTM, Thermofisher, kuva 1b, c). Konvektio voidaan periaatteessa välttää, jos nesteen paksuus on pienempi kuin lämmityslaserin säteen koko. Toiseksi tällaisessa rajoitetussa geometriassa työskentely voi tukahduttaa aerobiset organismit (katso kuva S2). Tämä ongelma voidaan välttää käyttämällä happea (tai muuta elintärkeää kaasua) läpäisevää alustaa, jättämällä ilmakuplia peittolasiin tai poraamalla reiät yläpeitelasiin (katso kuva S1) 45 . Tässä tutkimuksessa valitsimme jälkimmäisen ratkaisun (kuvat 1b ja S1). Lopuksi laserlämmitys ei tarjoa tasaista lämpötilan jakautumista. Jopa lasersäteen samalla intensiteetillä (kuva 1d) lämpötilajakauma ei ole tasainen, vaan pikemminkin muistuttaa Gaussin jakaumaa lämpödiffuusiosta johtuen (kuva 1e). Kun tavoitteena on määrittää tarkat lämpötilat näkökentässä biologisten järjestelmien tutkimista varten, epätasaiset profiilit eivät ole ihanteellisia ja voivat myös johtaa bakteerien termoforeettiseen liikkeeseen, jos ne eivät tartu alustaan (ks. kuva S3, S4)39. Tätä tarkoitusta varten käytimme spatiaalista valomodulaattoria (SLM) muotoilemaan infrapunalasersäteen renkaan muodon mukaan (kuva 1f) näytteen tasossa saavuttaaksemme täysin tasaisen lämpötilan jakautumisen tietyllä geometrisella alueella. lämpödiffuusiosta huolimatta (kuva 1d) 39 , 42, 46. Aseta ylempi peitinlasi metallimaljan päälle (kuva 1b) väliaineen haihtumisen välttämiseksi ja tarkkaile vähintään muutaman päivän ajan. Koska tätä ylempää peitinlasia ei ole tiivistetty, lisää väliainetta voidaan helposti lisätä milloin tahansa tarvittaessa.
Havainnollistaaksemme LA-HTM:n toimintaa ja sen soveltuvuutta termofiiliseen tutkimukseen tutkimme aerobisia Geobacillus stearothermophilus -bakteereja, joiden optimaalinen kasvulämpötila on noin 60-65 °C. Bakteerilla on myös siima ja kyky uida, mikä tarjoaa toisen indikaattorin normaalista solutoiminnasta.
Näytteitä (kuvio 1b) esi-inkuboitiin 60 °C:ssa yksi tunti ja asetettiin sitten LA-HTM-näytepidikkeeseen. Tämä esi-inkubointi on valinnainen, mutta silti hyödyllinen kahdesta syystä: Ensinnäkin, kun laser kytketään päälle, se saa solut välittömästi kasvamaan ja jakautumaan (katso elokuva M1 lisämateriaalista). Ilman esi-inkubointia bakteerien kasvu viivästyy tyypillisesti noin 40 minuuttia joka kerta, kun näytteelle kuumennetaan uusi katselualue. Toiseksi 1 tunnin esi-inkubointi edisti bakteerien tarttumista peitelasiin, mikä esti soluja ajautumasta pois näkökentästä termoforeesin vuoksi, kun laser käynnistettiin (katso elokuva M2 lisämateriaaleista). Termoforeesi on hiukkasten tai molekyylien liikkumista lämpötilagradienttia pitkin, yleensä kuumasta kylmään, eivätkä bakteerit ole poikkeus43,47. Tämä ei-toivottu vaikutus eliminoidaan tietyltä alueelta käyttämällä SLM:ää lasersäteen muotoilemiseksi ja tasaisen lämpötilajakauman saavuttamiseksi.
Kuvassa Kuvassa 2 on esitetty CGM:llä mitattu lämpötilajakauma, joka on saatu säteilyttämällä kullan nanohiukkasilla päällystettyä lasisubstraattia rengasmaisella lasersäteellä (kuva 1f). Tasainen lämpötilajakauma havaittiin koko lasersäteen peittämälle alueelle. Tämä vyöhyke asetettiin 65 °C:seen, optimaaliseen kasvulämpötilaan. Tämän alueen ulkopuolella lämpötilakäyrä putoaa luonnollisesti arvoon \(1/r\) (jossa \(r\) on säteittäinen koordinaatti).
CGM-mittausten lämpötilakartta, joka on saatu käyttämällä rengasmaista lasersädettä säteilyttämään kullan nanopartikkelikerros tasaisen lämpötilaprofiilin saamiseksi pyöreällä alueella. b Lämpötilakartan isotermi (a). Lasersäteen ääriviivaa edustaa harmaa katkoviiva ympyrä. Koe toistettiin kahdesti (katso lisämateriaalit, kuva S4).
Bakteerisolujen elinkelpoisuutta seurattiin useiden tuntien ajan LA-HTM:llä. Kuvassa Kuva 3 näyttää aikavälin neljälle kuvalle, jotka on otettu 3 tunnin 20 minuutin elokuvasta (Movie M3, Supplementary Information). Bakteerien havaittiin lisääntyvän aktiivisesti laserin määrittelemällä pyöreällä alueella, jossa lämpötila oli optimaalinen, lähestyen 65 °C:ta. Sitä vastoin solujen kasvu väheni merkittävästi, kun lämpötila laski alle 50 °C 10 sekunnin ajaksi.
Optiset syvyyskuvat G. stearothermophilus -bakteerista, jotka kasvavat laserlämmityksen jälkeen eri aikoina, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, ulos 200 Otettu yhden minuutin filmistä (M3-kalvo lisätiedoissa), joka on asetettu vastaavan lämpötilakartan päälle. Laser käynnistyy hetkellä \(t=0\). Isotermit on lisätty intensiteettikuvaan.
Solujen kasvun ja sen lämpötilariippuvuuden mittaamiseksi edelleen määritimme alun perin eristettyjen bakteerien eri pesäkkeiden biomassan kasvun Movie M3 -näkökentässä (kuva 4). Minikolonia muodostavan yksikön (mCFU) muodostumisen alussa valitut emobakteerit on esitetty kuvassa S6. Kuivamassamittaukset tehtiin CGM 48 -kameralla, jota käytettiin lämpötilajakauman kartoittamiseen. CGM:n kyky mitata kuivapainoa ja lämpötilaa on LA-HTM:n vahvuus. Kuten odotettiin, korkea lämpötila aiheutti nopeamman bakteerikasvun (kuva 4a). Kuten kuvion 4b puolilogaristisesta käyrästä näkyy, kasvu kaikissa lämpötiloissa seuraa eksponentiaalista kasvua, jossa data käyttää eksponentiaalista funktiota \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), jossa \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}2\) – sukupolven aika (tai tuplausaika), \( g =1/ \tau\) – kasvunopeus (jakojen määrä aikayksikköä kohti ). Kuvassa Kuva 4c esittää vastaavan kasvunopeuden ja synnytysajan lämpötilan funktiona. Nopeasti kasvaville mCFU:ille on ominaista kasvun kyllästyminen kahden tunnin kuluttua, mikä on odotettu käyttäytyminen korkeasta bakteeritiheydestä (samanlainen kuin stationaarifaasi klassisissa nesteviljelmissä). Yleinen muoto \(g\left(T\right)\) (kuvio 4c) vastaa odotettua kaksivaiheista käyrää G. stearothermophilus -bakteerille optimaalisen kasvunopeuden ollessa noin 60-65 °C. Yhdistä tiedot käyttämällä kardinaalimallia (kuva S5)49, jossa \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, mikä sopii hyvin yhteen muiden kirjallisuudessa mainittujen arvojen kanssa49. Vaikka lämpötilasta riippuvat parametrit ovat toistettavissa, \({G}_{0}\) maksimikasvunopeus voi vaihdella kokeesta toiseen (katso kuvat S7-S9 ja elokuva M4). Toisin lämpötilan sovitusparametreille, joiden pitäisi olla universaaleja, suurin kasvunopeus riippuu väliaineen ominaisuuksista (ravinteiden saatavuus, happipitoisuus) havaitun mikromittakaavan geometriassa.
a Mikrobien kasvu eri lämpötiloissa. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Tiedot saatu videosta yksittäisestä bakteerista, joka kasvaa lämpötilagradientissa (elokuva M3). b Sama kuin (a), puolilogaritminen asteikko. c Lineaarisesta regressiosta (b) laskettu kasvunopeus\(\tau\) ja sukupolven aika\(g\). Vaakasuuntaiset virhepalkit: lämpötila-alue, jonka yli mCFU:t laajenivat näkökenttään kasvun aikana. Pystysuuntaiset virhepalkit: lineaarisen regression standardivirhe.
Normaalin kasvun lisäksi jotkut bakteerit leijuivat joskus näkyville laserlämmityksen aikana, mikä on odotettua käyttäytymistä siimabakteerien suhteen. Lisätiedoissa oleva elokuva M5 esittää tällaisia uintiharrastuksia. Tässä kokeessa käytettiin tasaista lasersäteilyä lämpötilagradientin luomiseen, kuten on esitetty kuvissa 1d, e ja S3. Kuvassa 5 on kaksi M5-elokuvasta valittua kuvasekvenssiä, jotka osoittavat, että yksi bakteeri osoittaa suunnattua liikettä, kun taas kaikki muut bakteerit pysyvät liikkumattomina.
Kaksi aikakehystä (a) ja (b) osoittavat kahden eri bakteerin uinnin, jotka on merkitty pisteympyröillä. Kuvat on poimittu M5-elokuvasta (toimitettu lisämateriaalina).
G. stearothermophilus -bakteerin tapauksessa bakteerien aktiivinen liike (kuvio 5) alkoi muutaman sekunnin kuluttua lasersäteen kytkemisestä päälle. Tämä havainto korostaa tämän termofiilisen mikro-organismin ajallista vastetta lämpötilan nousuun, kuten Mora et ai. 24 . Bakteerien liikkuvuutta ja jopa termotaksiaa voidaan tutkia edelleen LA-HTM:n avulla.
Mikrobiuintia ei pidä sekoittaa muun tyyppiseen fyysiseen liikkeeseen, nimittäin (i) Brownin liikkeeseen, joka näyttää olevan kaoottista liikettä ilman tiettyä suuntaa, (ii) konvektioon 50 ja termoforeesiin 43, jotka koostuvat säännöllisestä liikkeen ajautumisesta lämpötilaa pitkin. kaltevuus.
G. stearothermophilus tunnetaan kyvystään tuottaa erittäin vastustuskykyisiä itiöitä (itiömuodostusta), kun se altistuu epäsuotuisille ympäristöolosuhteille suojana. Kun ympäristöolosuhteet muuttuvat jälleen suotuisiksi, itiöt itävät, muodostavat eläviä soluja ja jatkavat kasvua. Vaikka tämä itiöinti-/itämisprosessi tunnetaan hyvin, sitä ei ole koskaan havaittu reaaliajassa. Käytämme LA-HTM:ää, raportoimme tässä ensimmäisen havainnon itämistapahtumista G. stearothermophilusissa.
Kuvassa Kuva 6a esittää aikajaksotettuja kuvia optisesta syvyydestä (OT), joka on saatu käyttämällä 13 itiön CGM-sarjaa. Koko keräysajan (15 h 6 min, \(t=0\) – laserlämmityksen alku) itiöistä 4/13 itiötä peräkkäisinä ajankohtina \(t=2\) h, \( 3\) ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' ja \(11\) h \(30\)'. Vaikka vain yksi näistä tapahtumista on esitetty kuvassa 6, 4 itämistapahtumaa voidaan havaita M6-elokuvassa lisämateriaalissa. Mielenkiintoista on, että itävyys näyttää sattumanvaraiselta: kaikki itiöt eivät itä eivätkä itä samaan aikaan huolimatta samoista ympäristöolosuhteiden muutoksista.
aikaviive, joka koostuu 8 OT-kuvasta (öljyimmersio, 60x, 1,25 NA-objektiivi) ja (b) G. stearothermophilus -aggregaattien biomassan kehitys. c (b) Piirretty puolilogaiselle asteikolle kasvunopeuden lineaarisuuden korostamiseksi (katkoviiva).
Kuvassa Kuvat 6b,c esittävät solupopulaatioiden biomassaa näkökentässä ajan funktiona koko tiedonkeruujakson ajalta. Kuivan massan nopea hajoaminen, joka havaittiin kohdassa \(t=5\)h kuvassa 6b, c, johtuen joidenkin solujen poistumisesta näkökentästä. Näiden neljän tapahtuman kasvuvauhti on \(0,77\pm 0,1\) h-1. Tämä arvo on suurempi kuin kasvunopeus, joka liittyy kuvioihin 3. 3 ja 4, joissa solut kasvavat normaalisti. Syy G. stearothermophilusin lisääntyneelle kasvunopeudelle itiöistä on epäselvä, mutta nämä mittaukset korostavat LA-HTM:n kiinnostusta ja työskentelevät yksittäisen solun tasolla (tai yhden mCFU:n tasolla) saadakseen lisätietoja solujen elämän dynamiikasta .
LA-HTM:n monipuolisuuden ja sen suorituskyvyn korkeissa lämpötiloissa osoittamiseksi edelleen tutkimme Sulfolobus shibataen kasvua, joka on hypertermofiilinen asidofiilinen arkea, jonka optimaalinen kasvulämpötila on 80 °C51. Verrattuna G. stearothermophilukseen näillä arkeilla on myös hyvin erilainen morfologia, ja ne muistuttavat 1 mikronin palloja (kokkia) pikemminkin kuin pitkänomaisia sauvoja (basilleja).
Kuva 7a koostuu peräkkäisistä optisista syvyyskuvista S. shibatae mCFU:sta, jotka on saatu käyttämällä CGM:ää (katso M7-filmi lisämateriaaleista). Tämä mCFU kasvaa noin 73 °C:ssa, 80 °C:n optimilämpötilan alapuolella, mutta aktiivisen kasvun lämpötila-alueella. Havaitsimme useita fissiotapahtumia, jotka saivat mCFU:t näyttämään arkean mikrorypäleiltä muutaman tunnin kuluttua. Näistä OT-kuvista mCFU-biomassa mitattiin ajan kuluessa ja esitettiin kuvassa 7b. Mielenkiintoista on, että S. shibataen mCFU:t osoittivat lineaarista kasvua pikemminkin kuin eksponentiaalista kasvua, joka havaittiin G. stearothermophilus mCFU:illa. Solujen kasvunopeuden luonteesta on käyty pitkään keskustelua 52: kun jotkut tutkimukset raportoivat mikrobien kasvunopeudet, jotka ovat verrannollisia niiden kokoon (eksponentiaalinen kasvu), toiset osoittavat vakionopeutta (lineaarinen tai bilineaarinen kasvu). Kuten Tzur et al.53 selittävät, eksponentiaalisen ja (bi)lineaarisen kasvun erottaminen edellyttää <6 %:n tarkkuutta biomassamittauksissa, mikä on useimpien QPM-tekniikoiden ulottumattomissa, jopa interferometriaa käytettäessä. Kuten Tzur et al.53 selittävät, eksponentiaalisen ja (bi)lineaarisen kasvun erottaminen edellyttää <6 %:n tarkkuutta biomassamittauksissa, mikä on useimpien QPM-tekniikoiden ulottumattomissa, jopa interferometriaa käytettäessä. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% ижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Kuten Zur ym.53 selittävät, eksponentiaalisen ja (bi)lineaarisen kasvun erottaminen vaatii <6 % tarkkuutta biomassamittauksissa, mikä ei ole saavutettavissa useimmilla QPM-menetelmillä edes interferometriaa käytettäessä.Kuten Zur et ai. 53, eksponentiaalisen ja (bi)lineaarisen kasvun erottaminen vaatii alle 6 %:n tarkkuuden biomassamittauksissa, mikä ei ole saavutettavissa useimmilla QPM-menetelmillä, vaikka käytettäisiin interferometriaa. CGM saavuttaa tämän tarkkuuden sub-pg tarkkuudella biomassamittauksissa36,48.
aikaviive, joka koostuu 6 OT-kuvasta (öljyimmersio, 60x, NA-objektiivi 1,25) ja (b) mikro-CFU-biomassan kehitys CGM:llä mitattuna. Katso elokuva M7 saadaksesi lisätietoja.
S. shibataen täysin lineaarinen kasvu oli odottamatonta, eikä sitä ole vielä raportoitu. Eksponentiaalista kasvua odotetaan kuitenkin ainakin siksi, että ajan myötä 2, 4, 8, 16 … solujen moninkertainen jakautuminen on tapahduttava. Oletimme, että lineaarinen kasvu saattaa johtua solujen estämisestä, joka johtuu tiheästä solupakkauksesta, aivan kuten solujen kasvu hidastuu ja saavuttaa lopulta lepotilan, kun solutiheys on liian korkea.
Päätämme keskustelemalla vuorollaan seuraavista viidestä kiinnostavasta kohdasta: lämmitystilavuuden vähentäminen, termisen inertian vähentäminen, kiinnostus kultananohiukkasiin, kiinnostus kvantitatiiviseen faasimikroskooppiin ja mahdollinen lämpötila-alue, jolla LA-HTM:ää voidaan käyttää.
Resistiiviseen lämmitykseen verrattuna HTM-kehityksessä käytetty laserlämmitys tarjoaa useita etuja, joita havainnollistamme tässä tutkimuksessa. Erityisesti nestemäisissä väliaineissa mikroskoopin näkökentässä kuumennustilavuus pidetään muutaman (10 μm) 3 tilavuuden sisällä. Tällä tavalla vain havaitut mikrobit ovat aktiivisia, kun taas muut bakteerit ovat lepotilassa ja niitä voidaan käyttää näytteen lisätutkimukseen – näytettä ei tarvitse vaihtaa aina, kun uusi lämpötila on tarkistettava. Lisäksi mikromittakaavakuumennus mahdollistaa laajan lämpötila-alueen suoran tutkimisen: Kuva 4c on saatu 3 tunnin elokuvasta (Movie M3), joka vaatii yleensä useiden näytteiden valmistelua ja tutkimista – yksi jokaiselle tutkittavalle näytteelle. y on lämpötila, joka edustaa kokeen päivien lukumäärää. Kuumennetun tilavuuden pienentäminen pitää myös mikroskoopin kaikki ympäröivät optiset komponentit, erityisesti objektiivilinssin, huoneenlämmössä, mikä on ollut tähän asti yhteisön suuri ongelma. LA-HTM:ää voidaan käyttää minkä tahansa objektiivin kanssa, mukaan lukien öljyimmersiolinssit, ja se pysyy huoneenlämpötilassa jopa äärimmäisissä lämpötiloissa näkökentässä. Tässä tutkimuksessa raportoimamme laserlämmitysmenetelmän päärajoitus on, että solut, jotka eivät kiinnity tai kellu, voivat olla kaukana näkökentästä ja vaikeasti tutkittavia. Kiertokeino voisi olla käyttää vähän suurentavaa linssiä, jotta saavutetaan suurempi, yli muutaman sadan mikronin lämpötilan nousu. Tähän varovaisuuteen liittyy spatiaalisen erottelukyvyn heikkeneminen, mutta jos tavoitteena on tutkia mikro-organismien liikkumista, suurta spatiaalista resoluutiota ei tarvita.
Järjestelmän lämmityksen (ja jäähdytyksen) aikaasteikko \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) riippuu sen koosta, lain mukaan \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), missä \ (L\ ) on lämmönlähteen tyypillinen koko (lasersäteen halkaisija tutkimuksessamme on \(L\ noin 100\) μm), \(D\) on ympäristön lämpödiffuusivuus (keskiarvo meillä kotelo, lasi ja vesi Diffuusionopeus\(D\ noin 2\kertainen {10}^{-7}\) m2/s). Tämä välitön lämpötilan nousu ei ainoastaan lyhennä kokeen kestoa, vaan mahdollistaa myös tarkan ajoituksen \(t=0\) kaikille lämpötilavaikutusten dynaamisille tutkimuksille.
Ehdottamamme menetelmä on sovellettavissa mille tahansa valoa absorboivalle alustalle (esimerkiksi kaupallisille näytteille, joissa on ITO-pinnoite). Kullan nanohiukkaset pystyvät kuitenkin tarjoamaan korkean absorption infrapunassa ja alhaisen absorption näkyvällä alueella, joiden jälkimmäiset ominaisuudet ovat kiinnostavia tehokkaan optisen havainnoinnin kannalta näkyvällä alueella, erityisesti käytettäessä fluoresenssia. Lisäksi kulta on bioyhteensopivaa, kemiallisesti inerttiä, optista tiheyttä voidaan säätää 530 nm:stä lähiinfrapunaan ja näytteen valmistus on yksinkertaista ja taloudellista29.
Poikittainen hila-aaltorintamikroskooppi (CGM) mahdollistaa lämpötilan kartoituksen mikromittakaavassa, mutta myös biomassan seurannan, mikä tekee siitä erityisen hyödyllisen (jos ei ole tarpeen) yhdessä LA-HTM:n kanssa. Viimeisen vuosikymmenen aikana on kehitetty muita lämpötilamikroskopiatekniikoita, erityisesti biokuvantamisen alalla, ja useimmat niistä edellyttävät lämpötilaherkkien fluoresoivien koettimien käyttöä54,55. Näitä menetelmiä on kuitenkin kritisoitu, ja joissakin raporteissa on mitattu epärealistisia lämpötilan muutoksia soluissa, mikä saattaa johtua siitä, että fluoresenssi riippuu monista muista tekijöistä kuin lämpötilasta. Lisäksi useimmat fluoresoivat koettimet ovat epävakaita korkeissa lämpötiloissa. Siksi QPM ja erityisesti CGM edustavat ihanteellista lämpötilamikroskopiatekniikkaa elämän tutkimiseen korkeissa lämpötiloissa käyttämällä optista mikroskopiaa.
Optimaalisesti 80 °C:ssa elävän S. shibataen tutkimukset osoittavat, että LA-HTM:ää voidaan soveltaa hypertermofiilien, ei vain yksinkertaisten termofiilien, tutkimiseen. Periaatteessa LA-HTM:llä saavutettavien lämpötilojen vaihteluväliä ei ole rajoitettu, ja jopa yli 100 °C:n lämpötilat voidaan saavuttaa ilmakehän paineessa ilman kiehumista, kuten ryhmämme 38 osoittaa hydrotermisen kemian sovelluksissa ilmakehän lämpötilassa. paine A. Laseria käytetään kullan nanohiukkasten 40 lämmittämiseen samalla tavalla. Siten LA-HTM:ää voidaan käyttää ennennäkemättömien hypertermofiilien havainnointiin tavallisella korkearesoluutioisella optisella mikroskopialla normaaleissa olosuhteissa (eli ympäristön rasituksessa).
Kaikki kokeet suoritettiin kotitekoisella mikroskoopilla, mukaan lukien Köhler-valaistus (LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), näytepidike manuaalisella xy-liikkeellä, objektiivit (Olympus, 60x, 0,7 NA, ilma, LUCPlanFLN60X tai 60x, 1,25 , UPLFLN60XOI), CGM-kamera (QLSI-ristikkoritilä, 39 µm:n jako, 0,87 mm Andor Zyla -kameran tunnistimesta) intensiteetin ja aaltorintaman kuvantamiseen, ja sCMOS-kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bittinen tila, Hamamatsulta) tallentamaan kuvassa 5 esitetyt tiedot (bakteeriuinti). Dikroinen säteen jakaja on 749 nm:n BrightLine-reuna (Semrock, FF749-SDi01). Kameran etuosassa oleva suodatin on 694 lyhytpäästösuodatin (FF02-694/SP-25, Semrock). Titaanisafiirilaser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpattu tsunamilaserontelo, Spectra-Physics kuvassa 2-5, edelleen korvattu Millenia laserilla, Spectraphysics 10 W, pumpattu Mira-laserontelo, koherentti, kuvassa 2 -5). 6 ja 7) on asetettu aallonpituuksille \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, mikä vastaa kullan nanohiukkasten plasmoniresonanssispektriä. Tilavalomodulaattorit (1920 × 1152 pikseliä) ostettiin Meadowlark Opticsilta. Hologrammit laskettiin käyttämällä Gerchberg-Saxton-algoritmia, kuten linkissä on kuvattu.
Cross Grating Wavefront Microscopy (CGM) on optinen mikroskooppitekniikka, joka perustuu kaksiulotteisen diffraktiohilan (tunnetaan myös nimellä ristikkäinen hila) yhdistämiseen yhden millimetrin etäisyydellä tavanomaisesta kameran anturista. Yleisin esimerkki CGM:stä, jota olemme käyttäneet tässä tutkimuksessa, on nimeltään neljän aallonpituuden poikittaissiirtointerferometri (QLSI), jossa ristikkäinen hila muodostuu Primotin et al. käyttöön ottama ja patentoima intensiteetti/vaiheinen shakkitaulukuvio. Vuonna 200034. Pysty- ja vaakasuuntaiset hilaviivat luovat anturiin ristikkomaisia varjoja, joiden vääristymiä voidaan käsitellä reaaliajassa numeerisesti tulevan valon optisen aaltorintaman vääristymän (tai vastaavan vaiheprofiilin) saamiseksi. Mikroskoopissa käytettynä CGM-kamera voi näyttää kuvatun kohteen optisen polun eron, joka tunnetaan myös nimellä optinen syvyys (OT), jonka herkkyys on nanometrien luokkaa36. Kaikissa CGM-mittauksissa optisten komponenttien tai säteiden vikojen poistamiseksi on otettava ensisijainen OT-vertailukuva, joka on vähennettävä kaikista myöhemmistä kuvista.
Lämpötilamikroskopia suoritettiin käyttämällä CGM-kameraa, kuten viitteessä on kuvattu. 32. Lyhyesti sanottuna nesteen kuumentaminen muuttaa sen taitekerrointa, jolloin syntyy lämpölinssivaikutelma, joka vääristää tulevaa sädettä. Tämä aaltorintaman vääristymä mitataan CGM:llä ja käsitellään käyttämällä dekonvoluutioalgoritmia kolmiulotteisen lämpötilajakauman saamiseksi nestemäisessä väliaineessa. Jos kullan nanohiukkaset ovat jakautuneet tasaisesti koko näytteeseen, lämpötilakartoitus voidaan tehdä bakteereista vapailla alueilla parempien kuvien tuottamiseksi, kuten joskus teemme. Vertailu-CGM-kuva otettiin ilman lämmitystä (laser pois päältä) ja sen jälkeen siepattiin samassa kohdassa kuvassa laserin ollessa päällä.
Kuivamassan mittaus suoritetaan käyttämällä samaa CGM-kameraa, jota käytetään lämpötilakuvaukseen. CGM-vertailukuvat saatiin siirtämällä näytettä nopeasti x:ssä ja y:ssä altistuksen aikana keinona laskea keskiarvo OT:n epähomogeenisuudesta, joka johtuu bakteerien läsnäolosta. Bakteerien OT-kuvista niiden biomassa saatiin käyttämällä kuvasarjaa alueilta, jotka oli valittu käyttämällä Matlabin kotitekoista segmentointialgoritmia (katso alaosio ”Numeerinen koodi”) noudattaen viitteessä kuvattua menettelyä. 48. Lyhyesti sanottuna, käytämme relaatiota \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), missä \({{\mbox{OT}}}\vasen(x,y\oikea)\) on optinen syvyyskuva, \(m\) on kuivapaino ja \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) on vakio. Valitsimme \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, joka on tyypillinen vakio eläville soluille.
Peitelasi, jonka halkaisija oli 25 mm ja paksuus 150 µm, päällystetty kullan nanohiukkasilla, asetettiin AttofluorTM-kammioon (Thermofisher) kultaiset nanohiukkaset ylöspäin. Geobacillus stearothermophilus esiviljeltiin yön yli LB-elatusaineessa (200 rpm, 60 °C) ennen jokaista koepäivää. 5 µl:n tippa G. stearothermophilus -suspensiota, jonka optinen tiheys (OD) oli 0,3 - 0,5, asetettiin kultananohiukkasilla varustetulle peitinlasille. Sitten pisaran päälle pudotettiin halkaisijaltaan 18 mm pyöreä peitinlasi, jonka keskellä oli halkaisijaltaan 5 mm reikä, ja reiän keskelle laitettiin toistuvasti 5 μl bakteerisuspensiota, jolla oli sama optinen tiheys. Peitelasien kuopat valmistettiin viitteessä kuvatun menettelyn mukaisesti. 45 (katso lisätietoja kohdasta Lisätiedot). Lisää sitten peitinlasiin 1 ml LB-alustaa estääksesi nestekerroksen kuivumisen. Viimeinen peitinlasi asetetaan Attofluor™-kammion suljetun kannen päälle väliaineen haihtumisen estämiseksi inkuboinnin aikana. Itämiskokeissa käytimme itiöitä, jotka tavanomaisten kokeiden jälkeen joskus peittivät yläpeitelasin. Samanlaista menetelmää käytettiin Sulfolobus shibataen saamiseksi. Kolme päivää (200 rpm, 75 °C) Thiobacillus serratan esiviljelyä suoritettiin alustassa 182 (DSMZ).
Näytteet kultananohiukkasista valmistettiin misellilohkokopolymeerilitografialla. Tämä prosessi on kuvattu yksityiskohtaisesti kappaleessa. 60. Lyhyesti sanottuna kulta-ioneja kapseloivat misellit syntetisoitiin sekoittamalla kopolymeeri HAuCl4:n kanssa tolueenissa. Puhdistetut peitinlasit upotettiin sitten liuokseen ja käsiteltiin UV-säteilyllä pelkistimen läsnä ollessa kultasiementen saamiseksi. Lopuksi kultasiemeniä kasvatettiin saattamalla peitinlasi kosketukseen KAuCl4:n ja etanoliamiinin vesiliuoksen kanssa 16 minuutin ajan, mikä johti ei-pallomaisten kultananohiukkasten kvasijaksolliseen ja hyvin tasaiseen järjestelyyn lähi-infrapunassa.
Interferogrammien muuntamiseen OT-kuviksi käytimme kotitekoista algoritmia, kuten linkissä on kuvattu. 33 ja se on saatavana Matlab-pakettina seuraavassa julkisessa arkistossa: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paketti voi laskea intensiteetti- ja OT-kuvia tallennettujen interferogrammien (mukaan lukien vertailukuvat) ja kameraryhmän etäisyyksien perusteella.
SLM:ään sovelletun vaihekuvion laskemiseksi tietyn lämpötilaprofiilin saamiseksi käytimme aiemmin kehitettyä kotitekoista algoritmia39,42, joka on saatavilla seuraavassa julkisessa arkistossa: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Tulo on haluttu lämpötilakenttä, joka voidaan asettaa digitaalisesti tai yksivärisen bmp-kuvan kautta.
Solujen segmentointiin ja niiden kuivapainon mittaamiseen käytimme Matlab-algoritmiamme, joka on julkaistu seuraavassa julkisessa arkistossa: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Jokaisessa kuvassa käyttäjän on napsautettava kiinnostavaa bakteeria tai mCFU:ta, säädettävä sauvan herkkyys ja vahvistettava valinta.
Lisätietoja tutkimussuunnittelusta on tähän artikkeliin linkitetyssä Nature Research Reportin tiivistelmässä.
Tämän tutkimuksen tuloksia tukevat tiedot ovat saatavilla vastaavilta kirjoittajilta kohtuullisesta pyynnöstä.
Tässä tutkimuksessa käytetty lähdekoodi on kuvattu yksityiskohtaisesti Methods-osiossa, ja virheenkorjausversiot voidaan ladata osoitteesta https://github.com/baffou/ seuraavista arkistoista: SLM_temperatureShaping, CGMprocess ja CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Katsaus termofiileihin ja niiden laaja-alaisiin sovelluksiin. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Katsaus termofiileihin ja niiden laaja-alaisiin sovelluksiin.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. ja Sharma, AK Yleiskatsaus termofiileihin ja niiden laajaan käyttöön. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. ja Sharma AK Syvä ymmärrys termofiileista ja monenlaisista sovelluksista.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Postitusaika: 26.9.2022